基于改进QuEChERS法联合超高效液相色谱-质谱法的人参中禁用农药残留分析△

武晓丽，丁自勉*，柯润辉

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；

2.中轻检验认证有限公司，北京 100015

QuEChERS 是quick、easy、cheap、effective、rugged、safe的缩写，意即快速、简单、廉价、有效、坚固耐用和安全，是由美国科学家2003 年开发的一种用于蔬菜、水果中农药多残留测定的样品前处理方法，包括乙腈提取/分离和分散固相萃取净化2个主要过程[1]。为了使QuEChERS对复杂基质和分析物有更好的萃取效果，研究人员主要针对萃取盐析和吸附剂2 个关键因素进行优化[2]。前者由原始的非缓冲盐版本演化为2个官方分析方法，即以醋酸盐为缓冲液的美国AOAC 官方分析方法2007.01[3]和以柠檬酸盐为缓冲液的欧盟官方方法EN15662[4]。在吸附剂优化方面，主要评估不同吸附剂的净化效果[5]，如N-丙基乙二胺（PSA）通常用于去除脂肪酸、糖、有机酸和一些色素；十八烷基键合硅胶（C18）可有效地去除高脂样品；石墨化碳黑（GCB）主要去除共提色素（如叶绿素和类胡萝卜素等）；无水硫酸镁用于去除水分。经过改进后，QuEChERS 能够减少不稳定农药分解、减弱基质效应和提高农药回收率。

近年来，QuEChERS 在中药农药残留检测中的应用也日渐普及。例如，用无水硫酸镁1200 mg、C18100 mg、PSA 300 mg为净化剂，建立了广陈皮中39 种禁用农药的气相色谱-质谱法（GC-MS/MS）检测[6]；用商业化的QuEChERS 提取包和净化管，建立了贝母类药材中53种农药残留GC-MS/MS测定[7]。但是中药种类众多、基质复杂，除了富含色素、有机酸等基质外，还含有黄酮、萜、皂苷等类的药理活性成分[8]，经典的QuEChERS 净化包可能会吸附一部分农药，造成回收率下降[9]，因此，需要对净化剂的种类和配比进行调整。例如，在建立白芷中禁用农药残留检测方法时发现，因白芷药材中植物色素量较少，GCB 会吸附平面型农药，导致其回收率降低[10]；闫君等[11]针对当归中色素含量低，含有挥发油等特点，选择无水硫酸镁800 mg、PSA 150 mg和C18150 mg 进行净化，能够减弱基质效应，试验的102种农药的回收率为52%～128%。

随着《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版的实施，QuEChERS成为药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法的样品制备标准方法之一，其中分散固相萃取净化剂为无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅胶300 mg、GCB 90 mg[12]。但是在日常检测中，本研究团队发现上述吸附剂配比会造成一些禁用农药（如杀虫脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆）回收率偏低的问题。这可能是由于在部分中药基质中，某些吸附剂对目标农药产生吸附，因此需要对吸附剂配比进行调整。但目前尚未有针对上述现象的系统研究。

人参是一种常用的药食两用中药材，《中国药典》 2020 年版记载其为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效[13]。本研究以人参为例，对QuEChERS 吸附剂用量配比进行优化，用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）对30 种禁用农药进行检测，并对方法的回收率、重复性、线性等指标进行考察。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；5500QTRAP型质谱仪（美国AB SCⅠEX公司）；SiO-7512 型自动QuEChERS 样品制备系统（北京本立科技有限公司）。

1.2 试药

人参药材购于安国药材市场，由中国医学科学院药用植物研究所李国强副研究员鉴定为人参Panax ginsengC.A.Mey.，粉碎后过三号筛，置于-20 ℃冰箱中，备用；色谱纯乙腈和质谱级甲酸购自美国Fisher 公司；分析纯无水硫酸镁、无水醋酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；C18、PSA、硅胶、GCB 购自上海安谱实验科技股份有限公司；禁用农药混合对照品（批号：CDAA-M-490407-TX，2～20 mg·L-1）购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司，用前取0.5 mL稀释至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，备用。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS条件

2.1.1色谱条件 Thermo Scientific Hypersil GOLD色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～0.5 min，30%A；0.5～9.0 min，30%～90%A；9.0～13.0 min，90%A；13.0～14.0 min，90%～30%A；14.0～18.0 min，30%A）；流速为0.20 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量为2 μL。

2.1.2质谱条件 电喷雾离子源（ESⅠ），监测模式为多反应监测（MRM），正离子扫描；离子喷雾电压（ⅠS）+5.5 kV；离子源温度550 ℃，雾化气（GS1）压力50 psi（1 psi≈6.895 kPa），辅助气（GS2）压力50 psi，气帘气（CUR）压力35 psi。监测离子对、碰撞电压（CE）等参照《中国药典》2020年版，并根据仪器条件稍作调整（表1）。

表1 人参中各农药的tR、监测离子对及CE

2.2 样品前处理

2.2.1QuEChERS 样品前处理 参照《中国药典》（四部）2341农药残留量测定法第五法[12]：称取人参粉末3 g，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使浸润，放置30 min，加入无水硫酸镁与无水硫酸钠共7.5 g（4∶1）后立即摇散，振荡3 min，冰浴10 min，离心5 min（4000 r·min-1，离心半径为9.5 cm）。取上清液9 mL，置装有净化剂的分散固相萃取净化管中，涡旋混匀，剧烈振荡5 min 净化，离心5 min（4000 r·min-1，离心半径为9.5 cm）。精密吸取上清液5 mL，氮吹浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1.0 mL，精密加入水0.3 mL，混匀，过0.22 μm 滤膜，取续滤液待测。

2.2.2对照品溶液制备 取混合对照品0.5 mL 稀释至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，备用。

2.2.3吸附剂种类优化 分别使用1）经典分散固相萃取混合净化管（含无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅胶300 mg、GCB 90 mg）；2）PSA 300 mg和无水硫酸镁900 mg；3）C18300 mg和无水硫酸镁900 mg；4）硅胶300 mg和无水硫酸镁900 mg；5）GCB 90 mg 和无水硫酸镁900 mg；6）无水硫酸镁900 mg 的净化管对提取的人参基质进行净化处理，其他处理过程同2.2.1项。

2.2.4硅胶、C18和PSA 用量优化 在前期研究基础上，发现硅胶、C18和PSA 会造成部分农药回收率下降，因此进一步对其进行减量优化。当硅胶、C18和PSA 分别均为300、250、200、150、100 mg 时，考察农药的回收率。

2.3 加样回收试验和精密度

精密称定人参粉末3 g，分别添加禁用农药混合对照品（0.1～1.0 mg·L-1）30、300、600 μL，平行6次，按照2.2项下优化好的吸附剂用量进行样品处理，考察方法的回收率和相对标准偏差（RSD)。

2.4 方法的线性、定量下限（LLOQ）和基质效应（ME）

取人参样品粉末3 g，按照2.3项下方法制备空白溶液。取空白基质溶液1.0 mL（6份），氮吹浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀释至1.0 mL，涡旋混匀，即得基质匹配对照品。以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），通过计算和拟合得到标准曲线的线性方程、线性相关系数（r）。按照公式（1）计算农药残留分析中ME[9]。取标准曲线最低点，计算照信噪比为10∶1时的相应浓度为LLOQ。

ME=（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100% （1）

3 结果与分析

3.1 吸附剂种类优化

人参提取液经过2.2.3项下6种不同净化管处理后，30种禁用农药回收率结果见图1。第1～6种处理方式下，30 种禁用农药的回收率分别为59.6%～100.3%、68.8%～100.2%、75.2%～103.0%、60.8%～100.8%、84.7%～100.3%、82.6%～101.2%。经过商业化分散固相萃取混合净化管净化后，杀虫脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率都低于80%，分别为59.6%、69.8%、77.2%和61.4%；经过PSA 300 mg和MgSO4900 mg净化后，甲磺隆和氯磺隆的回收率低于80%，分别为76.6%、68.8%；经过C18300 mg或者硅胶300 mg净化后，杀虫脒的回收率均低于80%，分别为75.2%和60.8%；而经过GCB 90 mg 和无水硫酸镁900 mg 净化后，能够有效去除人参中少量色素，且所有农药的回收率都在80%以上；经过无水硫酸镁900 mg 净化后，所有农药的回收率都在80%以上，表明无水硫酸镁不会造成农药回收率降低。因此，推测可能是因为PSA对甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆等磺酰脲类除草剂有吸附作用，C18和硅胶对杀虫脒有吸附作用，造成这些农药的回收率降低。因此，进一步对这3 种吸附剂用量进行了优化，并对吸附机制进行探讨。

图1 不同净化剂处理后30种禁用农药回收率

3.2 硅胶、C18和PSA用量优化

硅胶表面有大量的羟基，有较强的极性，可以用于除去极性较大的杂质。C18表面有非极性碳链和部分未键合的硅醇官能团，可以除去非极性杂质和一些极性杂质。结果显示（图2A），随着C18和硅胶用量的减少，杀虫脒的回收率都逐渐增加。当硅胶用量从300 mg 减少到100 mg 时，杀虫脒回收率从60.8%逐渐提高到96.8%，尤其是当硅胶用量＞250 mg 时，杀虫脒的回收率＜70%。当C18从300 mg减少到100 mg 时，杀虫脒回收率从75.2%提高到86.5%，当C18用量＜200 mg 时，杀虫脒回收率＞80%。结果表明，过量的硅胶和C18都会对杀虫脒有吸附作用，且硅胶的吸附作用更强。推测可能是硅胶上未键合的羟基与极性较强的杀虫脒之间有吸附作用，C18和硅胶相比由于羟基的键合而对杀虫脒的吸附作用减弱。综上所述，C18和硅胶用于中药禁用农药残留净化时，应根据基质的种类不同，减少用量。例如，在人参基质中，当C18用量为100～150 mg、硅胶用量为100 mg 时，杀虫脒有较好的回收率（＞80%）。

PSA 是氨基吸附剂，其2 个氨基的酸度系数（pKa）分别为10.9、10.1[14]，能够吸附酸性杂质，可以用于样品中有机酸、脂肪酸及部分色素等基质的去除，但是过量的PSA 有可能会造成酸性农药的回收率降低。胺苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆的pKa 依次为4.20、3.75、3.40，都属于弱酸性农药。如图2B 所示，当PSA 用量＜200 mg 时，3 种磺酰脲类除草剂的回收率都达到80%以上。当PSA 从300 mg减少到100 mg 时，甲磺隆的回收率从76.5%增加到97.3%，胺苯磺隆回收率从83.6% 增加到100.6%，氯磺隆回收率从68.8%增加到104.9%。这可能是由于过量的PSA 和磺酰脲类除草剂上的氨基能够形成很强的吸附作用，导致甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率降低。实验中还发现，同等用量的PSA 时，农药的回收率胺苯磺隆＞甲磺隆＞氯磺隆，这可能是由于3 种农药的酸性依次增强（pKa 越小，酸性越强），与PSA 的吸附作用也增强，导致回收率降低。因此，当PSA 用于磺酰脲类农药的样品净化时，需要针对不同的基质，减少PSA 用量。

图2 农药吸附剂用量优化

综上所述，在按照《中国药典》2020 年版中的QuEChERS（无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅胶300 mg、GCB 90 mg 作为净化吸附剂）对人参中禁用农药进行检测时，发现C18和硅胶会使杀虫脒回收率降低，PSA 会使甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆回收率降低，因此需要减少硅胶、C18和PSA 的用量。当硅胶、C18和PSA 用量为100～150 mg时，杀虫脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆有较好的回收率（＞80%）。下面以硅胶100 mg、C18150 mg、PSA 150 mg 和GCB 90 mg 为例，用于人参基质中禁用农药的残留分析，考察方法的应用效果。

3.3 加样回收率和精密度

按照《中国药典》2020 年版规定，30 种禁用农药残留的限度值为0.02～0.20 mg·kg-1[12]，选择1/10限量值、限量值、2 倍限量值3 个添加水平，平行6次，在3.1、3.2项下优化好的条件下，考察方法准确性和重复性。30 种农药的回收率和RSD 见表2，回收率为76.4%～108.0%，RSD 为0.9%～7.8%，能够满足分析方法的要求。

表2 人参中30种禁用农药的添加回收率和RSD

续表2

3.4 方法的线性和定量下限

30 种农药在人参基质中含量的线性范围、线性方程、r及LLOQ见表3。r为0.993 9～0.999 9，均大于0.990，有较好的线性。所有农药的LLOQ均低于《中国药典》2020 年版定量限，能够用于30 种禁用农药残留的定量检测。

表3 人参中30种农药残留测定方法的线性和定量下限

3.5 ME

ME 在痕量分析中对结果的准确度有显著的影响。ME＞0 表示基质增强效应，ME＜0 表示基质减弱效应；ME＞50%或者＜-50%，表示有较强的基质效应；20%＜ME＜50%，或者-50%＜ME＜-20%，表示中等的基质效应；当ME 在-20%～20%时，表示较弱或者可以忽略不计的基质效应。30 种禁用农药在人参中的基质效应结果见图3。人参基质中有8种农药为基质增强效应（ME＞0），22 种农药为基质抑制效应（ME＜0）。有2 种农药呈现较强的基质效应，分别为苯线磷（51.4%）、水胺硫磷（-70.4%）。有9 种农药呈现中等的基质效应，如甲胺磷、甲磺隆等。有19 种农药（如杀虫脒、久效磷、3-羟基克百威等）呈现较弱或者可以忽略不计的基质效应。

图3 人参中30种禁用农药的基质效应

4 结论

本研究以人参为例，优化了QuEChERS 用于中药禁用农药残留样品前处理的净化剂种类和用量，并对可能的吸附机制进行了探讨。结果表明，过量的硅胶和C18会造成杀虫脒回收率降低，PSA 会造成甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等酸性农药回收率降低。对净化剂用量进行优化后，30 种禁用农药的回收率都能够满足要求，且方法有较好的精密度、线性和定量限。本研究在不更换吸附剂种类的情况下，对吸附剂用量进行配比优化，弥补经典QuEChERS 的不足，为其在中药农药残留，尤其是禁用农药残留的检测应用提供方法参考。