宁乡猪精液冷冻技术效果的研究

刘海林，罗子燕，朱立军，姜 虹，戴文静，燕海峰

（1.湖南光大牧业科技有限公司，湖南 长沙 410131；2.宁乡市动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410600；3.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131）

宁乡猪，原名流沙河猪或草冲猪，具有早熟易肥、肉质细嫩、肉味鲜美、耐粗饲、繁殖力高等特点，是国家级“双保”猪种。目前宁乡猪采取原生态保种方式（根据自然村划分的10个血缘系别进行车轮式交配）[1-2]。

猪冻精技术是指从公猪体内采集到的原精经过稀释、平衡、降温和冷冻等工艺处理之后，保存在-196 ℃的液氮中，抑制精子的生理代谢活动，从而达到长期储存的目的。使用时，将猪冻精放在特定的温度下，使其解冻复苏后恢复正常受精能力。相对于活体保种，通过精液冷冻技术保种具有以下优点：1）减轻保种工作量，降低保种成本；2）易于控制重大烈性疾病的传播；3）冻精保存年限可达200年，解决由于疾病、天灾人祸、近亲交配等带来的血缘灭绝问题；4）种群扩繁和恢复速度快[3]。

本试验通过分析宁乡猪冷冻前和冷冻后精液活力，对宁乡猪精液保种的应用、优化操作流程等进行探索，从而为避免因重大疫病对地方猪种的毁灭性打击、降低保种成本等提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2020年4—5月在湖南省畜牧兽医研究所进行。

1.2 主要仪器与试剂

视频温控显微镜（HW-39A，江西新怡光学仪器有限公司）；恒温水浴锅（HH-SI，金坛市医疗仪器厂）；电子冷暖箱（FYL-12MC-B3，北京福意联医疗设备有限公司）；程序冷冻仪（米尼图）；细管（0.25 mL，法国IMV卡苏科技股份有限公司）；精液稀释粉（AndroPro®Plus米尼图）；冷冻稀释粉（Androhep®CryoGuard，米尼图）；Equex-Paste（米尼图）；卵黄（采用新鲜鸡蛋自制）；解冻剂（Androhep CryoGuard Thaw，米尼图）。

1.3 试验方法

分别从上扶、下扶、花桥、山林、莲花、石柱、苏家7个地方取2岁左右成年宁乡种公猪各5头，每头重复采精3次，每次采集间隔5 d。

每次冻精制作完毕后，选取下扶、花桥、山林和石柱4个地方的猪冻精各1支（每次做3～5个重复样）进行常规解冻，然后与预热好的解冻液混匀，共同置于36 ℃水浴锅中，放置0.5、1、2、3 h后检测精子活力。

1.3.1 采精与预处理 采用手握法收集富含精子的精液（射精中间部分），采用4～6层过滤纸除去精液中的胶质部分；用预先配制好的等温稀释液（温差1 ℃内）按1∶1的比例倒入精液中，搅拌均匀，室温静置1 h后，放入17 ℃车载冰箱中，送回实验室。用米尼图精子分析系统测定稀释后精液的活力和密度，选择稀释活力超过0.4的精液进行下一步试验。

1.3.2 营养稀释剂的制备 卵黄液：采购市售新鲜褐壳鸡蛋，用70%酒精擦拭表面；晾干后打开蛋壳，倒出蛋白；把蛋黄在干净无绒的纸巾上呈口字型滚动，黏走剩余的蛋白；用无菌注射器把蛋黄吸到烧杯中备用。

稀释液：将45 g精液稀释粉溶解于1 L的蒸馏水中（预温32～37 ℃）。

冷冻保护液Ⅰ：将44 g冷冻稀释粉溶解于400 mL蒸馏水中（预温32～37 ℃），再加入100 mL鸡蛋黄，拌匀；冷却至15 ℃后待用。

冷冻保护液Ⅱ：将40.7 g冷冻稀释粉完全溶解于370 mL蒸馏水中（预温32～37 ℃），再加入100 mL鸡蛋黄，拌匀；再加入37.7 g（=30 mL）纯净甘油，拌匀；然后加入5 mL Equex paste，拌匀；冷却至5 ℃后待用。

解冻液：将50 g解冻剂溶解于1 L蒸馏水中（预温32～37 ℃）。

1.3.3 离心、稀释、平衡与装管 将稀释后的精液转移到50～80 mL的离心瓶里，在15 ℃和2 750 r/min的条件下离心12 min，弃上清液。

根据预设冻精密度，将计算好体积的冷冻保护液Ⅰ分批次缓慢加入到沉淀精子中，以吸吐方式混合均匀；再用剩余的冷冻保护剂Ⅰ洗涤离心管，合并到稀释后的精液中。

将稀释后的精液先放入一个盛有无菌蒸馏水（15 ℃）的200 mL烧杯中，再一同放入4 ℃的冰箱平衡1.5～2 h。

将冷冻保护液Ⅱ缓慢地加到4 ℃的精液中，轻轻晃动来混合均匀。

在5 ℃条件下，15 min内完成每头份精液的装管（0.25 mL），封口；再转移到5 ℃的冷冻冰柜中，平衡3 h，然后换高压灭菌的针头和导管，进行下一头份装管。

1.3.4 冷冻和解冻 将平衡后的细管迅速转移到应用程序冷冻仪中，降温冷冻程序为：5 ℃降至-10 ℃时间为3 min，-10 ℃降至-100 ℃的时间为2.5 min，-100 ℃降至-140 ℃时间为2 min，然后在-140 ℃下装入袋中，做好标记，最后快速投入液氮中。

从液氮罐中取1支细管，迅速放入38 ℃水浴锅中快速晃动30 s，剪去空气端，注入1 mL预热的解冻液中，摇匀放入水浴锅（38 ℃）静置1 min后用精子分析系统检测精液冻后质量。

1.3.5 精子活力与密度检测 通过米尼图精子分析系统选取样品中3处不同视角来测量精液稀释、平衡、解冻的活力和精子密度。

1.4 统计分析

数据用SPSS软件对各性状进行稀释、平衡、解冻的活力和密度的差异显著性检验和单因素方差分析比较，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同血缘系别宁乡猪精液质量参数

从表1可见，不同血缘系别宁乡猪精液射精量有显著差异（P＜0.05），其中花桥的宁乡猪显著高于其他地方宁乡猪（P＜0.05）；但是从后续研发试验中发现，花桥的原精量不稳定，这可能与人为因素（取射精中间部分的多少视现场情况而定）和公猪的饲养管理有关。

表1 不同血缘系别宁乡猪精液质量参数

不同血缘系别宁乡猪的稀释活力和稀释密度差异不显著（P＞0.05）。

本试验只测定了稀释活力，这是由于采精点比较分散，没有正规的检测设备，无法准确测定原精活力。

2.2 不同血缘系别宁乡猪精液经过稀释、平衡、解冻后的活力及其损失情况

从表2可见，不同血缘系别宁乡猪精液稀释活力和平衡活力均差异不显著（P＞0.05）；其中下扶、花桥、山林和苏家的宁乡猪平衡活力均高于稀释活力，这可能与精液经过离心等工艺去除部分死精和畸形精子有关。

表2 不同血缘系别宁乡猪精液经过稀释、平衡、解冻后的活力及其损失情况

不同血缘系别宁乡猪冻精解冻活力没有显著差异（P＞0.05）。其中山林和莲花宁乡猪解冻活力均优于其他地方的宁乡猪，并达到冻精配种使用标准（40%以上）。

大部分宁乡猪的平衡活力要略高于稀释活力，而解冻活力较稀释活力平均降低了19个百分点，这说明精子损失活力主要出现在精液平衡后到解冻之间，这可能与装管和冷冻过程中精子温度和渗透压等参数的变化有关，需要后续试验进一步优化流程，降低精子损失活力，从而提高冻精制作的成功率。

2.3 不同血缘系别宁乡猪精液解冻后活力维持情况

由表3可见，不同血缘系别宁乡猪精液解冻后活力在3 h内无显著下降趋势（P＞0.05）。在3 h内，花桥、山林和石柱宁乡猪的解冻活力在40%以上，达到了配种标准。

表3 不同血缘系别宁乡猪精液解冻后不同时间段的活力

3 讨论

3.1 本试验初步确定了宁乡猪的冻精制作方案，从原精选择、生产工艺和设备、营养稀释剂的制备、解冻活力及其维持情况等作系统性探索，结果表明，山林和莲花宁乡猪解冻活力均达到配种要求（40%以上），说明本试验冻精制作流程和方案是可行的。

3.2 李祥等（2016）报道大河乌猪的采精量233.23 mL；精子活力71.26%[4]；本试验测定宁乡猪平均采精量260.42 mL、稀释活力58.6%；后续试验中测定湖南其他地方猪种沙子岭、大围子和湘西铁骨猪的精子活力分别为64.8%、62.5%和72.2%（未发表）；由此可见，当地品种的公猪精子活力普遍较低，很难达到张树山等（2020）报道的猪冻精制作要求原精活力在70%以上[5]。本试验发现，宁乡猪冻精制作整个流程中，精子活力平均损失19个百分点，以40%的解冻活力标准，那么原精的稀释活力至少在57%以上；因而本试验初步确定稀释活力达到60%才可以进行下一步冻精制作。

3.3 本试验发现，宁乡猪精子活力在解冻后，可在3 h内达到配种标准，但具体能延长多长时间与具体实践使用环境和操作等有关。