黄连炭疽病病原鉴定及其对杀菌剂敏感性测定

莫维弟，方茜，程欢欢，周志成，丁海霞

摘要：以重庆市石柱县黄连中药材种植基地黄连叶片炭疽病病样为试材，通过病原菌分离、致病性测定、形态学特征结合ITS、GADPH、CHS1和ACT基因序列分析的方法对引起该病的病原进行鉴定，采用菌丝生长速率法测定了5种杀菌剂对病原菌的室内抑菌效果。结果表明：引起重庆市石柱县黄连中药材种植基地黄连叶片炭疽病病原为博宁炭疽菌（Colletotrichum boninense）。杀菌剂敏感性测定结果表明：5种杀菌剂对该病原菌均有抑制作用，其中40%异菌脲·氟啶胺悬浮剂（SC）抑制效果最好，EC50值为0.30 μg/mL。40%异菌脲·氟啶胺悬浮剂（SC）可作为防治黄连炭疽病的候选药剂。

关键词：黄连;炭疽病;博宁炭疽菌;杀菌剂;敏感性测定

中图分类号：S432文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2022）01-0028-006国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.01.004

Pathogen Identification of Anthracnose on Coptis chinensis and Its Sensitivity to Fungicides

Mo Weidi1，Fang Xi1，Cheng Huanhuan1，Zhou Zhicheng1，Ding Haixia1，2*

（1.College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Goldthread （Coptis chinensis）is a traditional Chinese medicine，where a typical anthracnose leaf spot disease was found in Shizhu county，Chongqing.To identify the pathogen，infected leaves were collected from goldthread fields.The pathogen was purified and then identified based on pathogenicity test，morphological characteristics observation and multilocus phylogenetic analyses （ITS、GADPH、CHS1and ACT）.And the sensitivities of the pathogen to 5 fungicides were evaluated.The results showed that the pathogen was identified as Colletotrichum boninense.The results of the sensitivities test showed that the 5 fungicides had inhibitory effects on the pathogen，of which，iprodione·fluazinam 40% SC had the best inhibition effect，with an EC50 values of 0.30 μg/mL.In words，iprodione·fluazinam 40% SC would be used as a candidate to control this disease in field.

Keywords：Coptis chinensis;anthracnose;Colletotrichum boninense;fungicides;sensitivity

黄连（Coptis chinensis）为毛茛科多年生草本植物，以根茎入药，具有泻火、解毒、清热、燥湿等功效，是我国常见中药材[1]。重庆市石柱县是黄连的主产区之一，产量约占我国总产量的60%[23]。随着黄连产业化和种植面积的增加，黄连病害的发生渐趋加重，其中黄连炭疽病发病率逐年上升[46]。黄连炭疽病主要危害叶片，严重时导致全叶枯死，植株萎蔫，严重影响黄连的品质和产量[6]。本研究对石柱县黄连炭疽病病原进行分离和致病性测定，依据病原菌形态学，结合ITS、GADPH、CHS1和ACT基因序列构建系统发育树对比分析，确定病原菌种类，并测定其对杀菌剂的敏感性，以期为黄连炭疽病的防治提供理论基础。

1材料与方法

1.1病害调查及症状观察

调查重庆市石柱县中药材基地黄连炭疽病的發生和危害情况，记录发病部位、典型症状。剪取黄连植株叶片发病组织，装于无菌塑料自封袋，带回实验室保存备用。

1.2病原菌的分离与鉴定

1.2.1病原菌分离

采用常规组织分离法[7]，切取黄连病叶病健交界处5 mm×5 mm的小块，经70%乙醇表面消毒1 min和无菌水洗3次后，接种到PDA平板上进行分离纯化培养，25  ℃恒温培养，待组织块周围长出菌落后，挑取菌落边缘进行纯化。纯化后的菌株做好标记后，置4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2形态学鉴定[7]

将分离到的菌株接种于PDA平板上，25 ℃恒温光照培养7 d后，观察记录菌落特征、生长速度，孢子形态等。收集无性孢子并用无菌水悬浮，将孢子悬浮液滴加至载玻片上，于25 ℃培养24 h后观察附着孢的产生。

1.2.3分子鉴定

采用真菌DNA提取试剂盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供试菌株DNA，选择引物ITS4/ITS5、GDF1/GDR1、CHS79F/CHS345R和ACT512 F/ACT783R[8]分别对ITS、GADPH、CHS1和ACT基因进行PCR扩增。扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，后将PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所得到的核苷酸序列在GenBank进行Blast同源性比较。将ITS、GADPH、CHS1和ACT基因序列上传至GenBank，其对应登录号分别为MN542218、MN542219、MN54 2220和MN542221。本研究根据Moriwaki[8]和Damm[9]获得用于构建系统发育树的菌株及其登录号 （表1），并从GenBank中下载参考序列，采用BioEdit软件处理4个保守基因ITS、GADPH、CHS1和ACT组合序列数据，应用自展法（bootstrap）用软件MEGA 7.0对菌株HL8构建系统进化树，自展数据为1000次。

1.2.4致病性测定

采用刺伤接种法[7]进行致病性测定。将纯化的菌株分别接种于PDA平板上，于25 ℃培養7 d，收集无性孢子并用无菌水悬浮，稀释至终浓度105 个/mL，取1年生健康黄连植株表面消毒后，用无菌接种针在叶片表面进行刺伤，采用喷雾法，将菌株的分子孢子悬浮液喷洒于刺伤处，以不接种的健康黄连作为空白对照，每个处理重复3次。置于温度25 ℃、相对湿度70%、光周期12 L∶12 D的条件下恒温培养，观察并记录发病情况，并对发病叶片再次进行病菌分离和鉴定。

1.3杀菌剂敏感性测定

采用菌丝生长速率法[7]，打取直径5 mm菌饼置于含不同药剂浓度 （表2）的PDA平板中央，以不添加药剂的PDA平板作对照。每个处理3次重复，25 ℃培养7d，采用十字交叉法[7]量取菌落直径，计算抑制率。抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%。使用Excel和DPS软件进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1病害症状

黄连是一种连作草本植物，在第4到第6年收获。2018-2019年，对重庆市石柱县约7公顷的黄连田块进行了调查，发现炭疽病在田间普遍存在，在黄连种植期均能发生。该病害主要危害黄连叶片，田间发病率为10%～100%，产量损失为10%～30%。5-6月雨水多时，发病尤其严重。发病前期叶片上产生零星病斑，圆形或椭圆形，产生油渍状的小点，以后逐渐扩大为褐色病斑，病斑中间灰白色，并着生小黑点（图1），后期病斑连成一片，发病严重时全叶枯死并引起黄连植株枯萎，严重影响黄连品质和产量。

2.2病原菌分离结果

根据病原菌形态学特征，从3份患病黄连样本中共分离出2株炭疽菌，形态、分子鉴定结果均一致，经致病性测定均能使黄连叶片发病，将其中1株命名为HL8，用于后续研究。

2.3病原菌形态学鉴定

如图2所示，在PDA培养基上25 ℃光照培养，菌落以1.1 cm/d的速度生长，在7 d后，菌落直径达8 cm。PDA培养基上生长较快，气生菌丝白色薄绒状，菌落生长后期可产生黑色分生孢子堆，分生孢子近椭圆形，无隔膜，大小为 （19.35～40.62） μm×（5.32～9.20） μm。附着孢单生，光滑，近梨形或倒梨形，（13.20～16.82） μm×（7.53～9.78）μm。它的菌落形态、分生孢子盘及分生孢子与已报道的博宁炭疽菌 （C.boninense）[8]形态一致。

2.4病原菌分子生物学鉴定

将获得的供试菌株的ITS、GADPH、CHS1和ACT基因序列提交至Genbank，序列登录号分别为MN542218，MN542219，MN542220和MN542221，并以此构建多基因系统发育树。如图3所示，供试菌株HL8与菌株CBS123755聚集于一支，且支持率达96%，能与其他种明显区分开。将4个基因序列同菌株CBS123755（JQ005153、JQ005240、JQ005501和JQ005327）进行blast，发现ITS、GADPH、CHS1和ACT基因的同源性分别为99.42% （512/515核苷酸）、100% （251/251核苷酸）、9927% （273/275核苷酸）和99.29% （278/280核苷酸）。因此，结合菌株形态学特征和分子生物学鉴定，将病原菌鉴定为博宁炭疽菌 （C.boninense）。

2.5致病性测定

如图4所示，接种后的叶片在25 ℃保湿培养48 h后开始出现症状，5 d后呈褐色病斑，对照未发病。从接种发病的叶片中再次分离得到的菌株与原接种菌株相同，表明该菌株为致病菌，可通过伤口侵染。

2.6杀菌剂敏感性测定

供试的5种杀菌剂对病原菌均有不同程度的抑制作用，其中，异菌脲·氟啶胺和多菌灵抑制效果最好，EC50值分别为0.30 μg/mL和0.46 μg/mL;其次为百菌清和精甲霜灵·代森锰锌，EC50值分别为13.27  μg/mL和37.89 μg/mL;再次为嘧菌酯·代森联，EC50值为84.66 μg/mL（表3）。

3结论与讨论

国内外关于黄连的研究主要集中于种质资源和药用价值，关于病害的研究报道较少，近年来在重庆地区由于规模化种植以及连作障碍，造成黄连病害日益加重[1011]，黄连炭疽病就是其中常见的主要病害之一。本研究从重庆石柱黄连种植基地分离典型炭疽病发病黄连植株，经致病性测定、柯赫氏法则验证、形态学特征及分子生物学鉴定[8]，将菌株HL8鉴定为博宁炭疽菌（C.boninense）。博宁炭疽菌可以危害太子参、油茶、滇黄精等植物，引起叶片坏死、腐烂、叶枯等[1216]。本研究首次报道了由博宁炭疽菌（C.boninense）引起的在重庆市石柱县严重发生的黄连炭疽病，与之前报道的引起湖北省恩施市板桥镇黄连炭疽病的病原菌一致[17]。

目前对该病害的防治措施主要是田间管理和化学药剂防治。合理密植，增强透光、透风条件，集中深埋或烧毁病残体等阻断初侵染源的手段可有效预防黄连炭疽病的发生[18]。肟菌·戊唑醇、苯醚甲环唑和嘧菌酯等常用于防治由博寧炭疽菌 （C.boninense）引起的植物病害[14，16]，其EC50分别为1.4925 μg/mL、14.7382 μg/mL和6.8886 μg/mL。本研究的杀菌剂室内敏感性测定表明异菌脲·氟啶胺在EC50值等于0.30 μg/mL时，抑菌效果最好，且均小于与市场常用防治药剂的EC50值，因此可作为大田药剂进一步研究。

本研究首次报道黄连炭疽病的病原菌为博宁炭疽菌（C.boninense），为该病害的识别和防治提供理论基础和参考意见。

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