广东始兴枇杷叶总黄酮提取工艺研究

刘慕妆，李紫宁，赵晨惠，范文静，陈礼培*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东 佛山 528231；2.广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东 佛山 528231；3.广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，广东 佛山 528231；4.佛山市酿造工程技术研究中心，广东 佛山 528231；5.佛山市农业生物制造工程技术研究中心，广东 佛山 528231）

枇杷是蔷薇科亚热带乔木，享有“天下第一果”的美称，是广东始兴名优特产水果之一，有近500 年栽培历史。2004 年，始兴被命名为“中国枇杷之乡”。枇杷叶被广泛关注，这是由于其具有祛痰、止咳止呕、和胃清肺、提高免疫力等功效［1-3］。枇杷叶有黄酮类［4］、三萜酸类［5］、倍半萜苷类［6］、多酚［7］和多糖［8］等主要成分。其中黄酮类化合物有清除体内自由基的功能，在抗氧化、抗病毒、降血糖、抑制炎症因子等方面展示了较好的生理活性，在治疗呼吸道疾病、心血管疾病及中毒性肝脏损伤等方面也有显著效果［9-10］，具有较高的应用价值。然而，始兴每年产生的大量枇杷叶大都作为落叶垃圾或直接焚烧处理，绝大部分枇杷叶没有被开发利用，这不仅造成了枇杷叶资源浪费，还引起一定程度的环境污染。若能够深入研究优化提取枇杷叶中总黄酮工艺，可成为提升始兴枇杷叶附加值的一种途径，使其“变废为宝”。

国内外枇杷叶总黄酮的提取方法主要有：回流提取［11］、纤维素酶辅助提取［12］、减压内部沸腾提取［13］、微波提取［14］、超声提取等［15］。其中，超声波辅助提取始兴枇杷叶的总黄酮，是一种较绿色、新颖的提取工艺，该提取方法具有穿透力强，选择性高，提取时间短，且溶剂用量较少的优点［16］。鉴此，本研究以始兴枇杷叶为原料，以枇杷叶总黄酮提取率作为指标，对超声波辅助乙醇法提取枇杷叶总黄酮的工艺进行研究，以获得枇杷叶总黄酮提取的最佳工艺，旨在为始兴枇杷叶的综合开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枇杷叶，广东始兴；芦丁标准品（AR≥98 %），北京索莱宝科技有限公司；去离子水，实验室自制；硝酸钠（分析纯），广州试剂公司；硝酸铝（分析纯），广州试剂公司；氢氧化钠（分析纯），广州试剂公司；无水乙醇（分析纯）；广州试剂公司。

1.2 仪器与设备

采用的仪器设备有：高频超声波清洗机SB25-12DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平ME2002/02，梅特勒-托利多；移液枪PL 系列，梅特勒-托利多；台式高速冷冻离心机ALLEGRA-64R，贝克曼；紫外分光光度计UV-2350，尤尼柯；恒温干燥箱DHG-9248A，上海精宏；多功能粉碎机GX-04，浙江高鑫工贸有限公司。

1.3 测定方法

1.3.1 枇杷叶总黄酮提取工艺流程

将枇杷叶于60 ℃干燥48 h，将干燥后的枇杷叶粉碎研磨并过80 目筛，得到枇杷叶粉末。按照一定的料液比，加入一定质量浓度的乙醇溶剂，在一定的温度下，超声提取一定的时间，超声提取结束后得到枇杷叶总黄酮提取样品，4 000 r/min 离心10 min，取0.5 mL 上清液进行总黄酮测定。

1.3.2 枇杷叶总黄酮测定方法

式中：C 为提取液中的黄酮含量，mg/mL；V 为提取液的体积，mL；N 为稀释倍数；m 为枇杷叶粉末的质量，mg。

1.3.3 单因素试验设计

称取1.00 g 枇杷叶粉末，以乙醇为提取溶剂，按下述试验设计进行单因素试验。

固定料液比1∶20 g/mL，超声时间40 min，乙醇体积分数60 %，改变超声温度（30、40、50、60、70、80 ℃），考察超声温度对始兴枇杷叶中的总黄酮提取率的影响；固定料液比1∶20 g/mL，超声时间40 min，超声温度50 ℃，改变乙醇体积分数（30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %），考察乙醇体积分数对始兴枇杷叶中的总黄酮提取率的影响；固定料液比1∶20 g/mL，乙醇体积分数60 %，超声温度50 ℃，改变超声时间（30、40、50、60、70、80 min），考察超声时间对始兴枇杷叶中的总黄酮提取率的影响；固定乙醇体积分数60 %，超声温度50 ℃，超声时间40 min，改变料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL），考察料液比对始兴枇杷叶中的总黄酮提取率的影响。

1.3.4 响应面试验设计

依据单因素试验结果，采用Box-Behnken的原理设计试验，以料液比、超声时间、乙醇体积分数、超声温度4 个因素作为自变量，分别用A、B、C、D 表示，低中高水平分别用-1、0、1 编码，用总黄酮提取率作为指标，实验设计水平如表1 所示。

一是播后苗前抢田间湿度好时选用异丙隆与丙草胺、氟唑磺隆等药剂混用进行土壤封闭；二是小麦苗龄达2叶1心-3叶1心（根据不同药剂来确定），抓住温湿度条件好时及早进行茎叶处理（抢用药），尽可能在杂草3叶期前用药，提高对抗性杂草的防除效果。

表1 响应面试验设计

1.3.5 统计分析

利用Design-Expert8.0.6 进行Box-Behnken 试验设计及数据分析，利用Excel 2010 进行数据整理和绘制图表。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对枇杷叶总黄酮提取率的影响

由图1 可知，始兴枇杷叶总黄酮提取过程中，提取溶剂太少时，物料中的黄酮类化合物提取不充分，提取率较低。当料液比在1∶10～1∶25 g/mL 范围内时，随着溶剂用量的增加，始兴枇杷叶中的总黄酮提取率不断增大，这是由于在溶剂用量增加的同时，也会增大枇杷叶粉末与乙醇溶液之间接触面积，有利于枇杷叶黄酮类化合物的释放。料液比为1∶25 g/mL 时，总黄酮提取率达到峰值，总黄酮可以最大限度地溶解出来。当继续增加提取溶剂的用量后，提取率反而减小，其原因可能是当溶剂用量太大的时候，一方面会导致一些大分子物质也溶解出来，比如可溶性蛋白物质［18］，竞争总黄酮的提取作用，影响了始兴枇杷叶中黄酮类化合物的提取效果［19］；另一方面过量的乙醇溶液会与黄酮类化合物发生化学反应，生成酚酸类物质［20］。而且乙醇溶液过多还浪费大量试剂，造成资源浪费［21］。

图1 料液比对总黄酮提取率的影响

2.1.2 超声时间对枇杷叶总黄酮提取率的影响

由图2 可知，枇杷叶总黄酮提取过程中，当超声时间太短时，黄酮类化合物仅部分溶解出来，无法达到完全提取。当超声时间在30～50 min 范围内时，随超声时间的延长，始兴枇杷叶总黄酮提取率逐渐增大。当超声时间增加至50 min 时提取率达到峰值，从枇杷叶粉末中溶解出来的目标成分含量最多，提取效果最好。但当继续增加提取时间时，提取率反而下降，这是由于超声时间过长，一方面，总黄酮已达到提取平衡，提取率不再增加，另一方面时间过长可能导致总黄酮降解或顺反异构化，导致黄酮提取率下降［22-23］。

图2 超声时间对总黄酮提取率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

植物中的黄酮大多是由苷元与糖组合而成，糖易溶于水，而苷元易溶于乙醇溶液。按照相似相溶原理，当提取溶剂与苷元极性相似时，有利于总黄酮溶出，提取率最大［24］。从图3 可看出，枇杷叶总黄酮提取过程中，随乙醇体积分数从40 %增大到60 %，总黄酮提取率呈上升趋势，于60 %时达到峰值。但乙醇体积分数继续增大时，提取率反而呈下降趋势。这是因为乙醇体积分数过大，又会导致一些醇溶性杂质溶解出来，干扰枇杷叶总黄酮的提取，造成提取率下降［25］。本研究选取60 %乙醇体积分数，此时提取率最大。

图3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.1.4 超声温度对总黄酮提取率的影响

从图4 可看出，枇杷叶中的总黄酮提取过程中，当温度从30 ℃升到60 ℃过程中，提取温度升高，分子扩散速度加快，传质速度提高，黄酮类化合物从枇杷叶转移至乙醇溶液中的速度因此加快，总黄酮提取率呈上升趋势，当超声温度为60 ℃时达到峰值。但当超声温度大于70 ℃时，总黄酮提取率明显减小，这是由于温度过高会导致黄酮类化合物中不耐热的苷元遭到破坏，反而降低总黄酮提取率［26］。本研究中超声温度60 ℃时，提取率最大。

图4 超声温度对总黄酮提取率的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

响应面试验结果见表2，由此可以看出，当料液比为1∶25 g/mL，超声时间为50 min，乙醇体积分数为60 %，超声温度为60 ℃时（实验编号26），提取率达到最大，为3.89 %。使用软件对表2 数据用回归模型进行分析，得到提取率对4 个因素的二次回归模型方程为：

2.2.2 回归模型拟合及方差分析

由表3 可知，该方程的F 值为42.49，P<0.000 1，此模型显著。方差进一步检验看出，A（料液比）、B（超声时间）、C（乙醇体积分数）、D（超声温度）、A2、B2、C2、D2、BD 影响显著（P<0.05），AB、AC、AD、BC、CD影响不显著。方程中失拟项的数值为P>0.05（P=0.968 5），不显著，表明该模型不失拟，即其他未检验因素对该试验的相关结果影响较小，可忽略不计。方程中的相关系数（R2=0.977 0）接近1，表明观察值和预测值之间具有较高的相关性，说明拟合程度好。Adj-R2=0.954 0，表明有95.40 %的响应值变化由4 个因素引起，说明拟合度较高。因此，该回归方程可以表示本试验各因素与枇杷叶总黄酮提取率之间的关系，能够用该模型对提取结果进行推测，并优化提取工艺。

表3 回归模型方差分析结果

试验结果中，F 值越大，P 值越小，即该因素对响应值影响越大，否则反之。根据F 值可知，对结果的影响强弱为B（超声时间）>D（超声温度）>A（料液比）>C（乙醇体积分数），即在4 个因素中对所需要提取的目标成分影响最大是超声时间与超声温度，其次是料液比，而乙醇体积分数对响应值的影响最小。

2.2.3 响应面交互作用分析

响应面图和等高线图能够较为直观反映各因素之间的交互作用。响应面图中曲面越陡峭说明研究因素之间的交互作用对结果影响越大，等高线呈椭圆形说明研究因素之间的交互作用显著，呈圆形则说明交互作用不显著［27-28］。由图5 可以看出，6 个响应面图均为开口向下的凸形曲面，同时，等高线最小椭圆的中心在所选的-1～1 范围内，说明响应值（枇杷叶总黄酮得率）在4 个因素设计的范围内存在最大值。

由图5a～c 可以看出，料液比和超声时间（AB）、料液比和乙醇体积分数（AC）、料液比和超声温度（AD）的等高线图呈较圆形，表示AB、AC、AD的交互作用对响应值的影响程度较为不显著（P＞0.05）。由图5d～f 可以看出，超声时间和乙醇体积分数（BC）、超声时间和超声温度（BD）以及超声温度和乙醇体积分数（CD）为椭圆形，表明两因素的交互作用对响应值的影响程度较为显著（P＜0.05）。其中，超声时间与超声温度（BD）的交互作用响应面图最为陡峭，等高线图呈椭圆形的弧度最大，所以它们的数值增加或减少对枇杷叶黄酮类化合物的提取影响最大。这与方差分析的结果相吻合。

图5 各因素对枇杷叶总黄酮提取率交互作用的响应面图和等高线图

由此，响应面法分析得到的枇杷叶中总黄酮提取的最佳工艺条件为：料液比1∶25.86 g/mL、超声温度63.6 ℃、超声时间54.2 min、乙醇体积分数62.4 %，此时枇杷叶中总黄酮的理论提取率达到了3.74 %。

2.2.4 验证试验

考虑到实际生产操作的便利性，对响应面分析得到的枇杷叶中总黄酮提取的最佳工艺条件稍作调整，选取料液比1∶26 g/mL、乙醇体积分数62 %、超声温度64 ℃、超声时间54 min 进行枇杷叶总黄酮提取的验证实验，得出在实际条件下始兴枇杷叶总黄酮提取率平均值为3.68 %，与理论值（3.74 %）基本一致，相对误差仅为1.6 %，该值与回归方程的预测值较为吻合，表明响应面法对枇杷叶总黄酮进行提取的研究是合理可行的，具有实际生产价值。

3 结语

本研究探讨了超声波辅助乙醇提取始兴枇杷叶总黄酮的最佳工艺条件。结果表明，料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度对枇杷叶总黄酮提取率均有显著影响（P<0.05），影响程度大小为：超声时间＞超声温度＞料液比＞乙醇体积分数。超声辅助乙醇提取始兴枇杷叶总黄酮的最佳提取工艺为：超声温度64 ℃、超声时间54 min、乙醇体积分数62 %、料液比1∶26 g/mL，总黄酮提取率为3.68 %，与预测值的相对误差为1.6 %。此工艺条件的确定，不但为综合开发利用始兴枇杷叶资源提供了科学依据，也为后续枇杷叶黄酮类化合物的富集与纯化及作用效果研究奠定了基础。