miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表达及其诊断价值研究

任玉峰，段秀方，程钰，孙柳青，张妍

1.安康市妇幼保健院病理科，陕西 安康 725000；

2.宁夏第五人民医院病理科，宁夏 石嘴山 753000；

3.安康市中心医院病理科，陕西 安康 725000；

4.北京理工大学珠海学院生物学教研室，广东 珠海 519088；

5.枣庄市市立医院病理科，山东 枣庄 277100

卵巢癌是临床上常见的妇科疾病，是女性恶性肿瘤之一，对女性的生命健康造成了严重威胁[1]。上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型，早期诊断比较困难，发现时多为晚期，目前尚没有可用于上皮性卵巢早期诊断及治疗和预后的特异性的生物学指标[2]。近年来研究发现，微小RNA(miRNA)表达水平的失调往往与癌症具有密切关系，具有促癌基因和抑癌基因[3]。miR-196a是miRNA家族成员之一。以往研究证实，miR-196a可以促进肝癌、胃癌及子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的形成，且在癌症患者血清中表达水平显著增加[4-5]。miR-1285可调控肿瘤抑制因子p53，研究显示miR-1285在肾癌、肝癌及卵巢癌等多种癌症中的表达水平显著降低，其可能是肿瘤抑制因子[6-7]。但是miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表达水平及其对上皮性卵巢癌的诊断价值尚不明确，本文就此展开研究，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取安康市妇幼保健院于2019年7月至2021年4月收治的95例拟行手术治疗的上皮性卵巢癌患者作为研究组。其中病理分期为Ⅰ期34例，Ⅱ期61例；病理类型：浆液性癌68例，透明细胞癌12例，黏液性癌8例，子宫内膜样癌5例及混合型细胞癌2例；病理分级：高分化癌(G1)5例、中分化癌(G2)18例和低分化癌(G3)72例；术后有残余肿瘤40例，术后无残余肿瘤55例。纳入标准：所有患者均符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和世界卫生组织(WHO)分级标准，且均经过病理诊断为上皮性卵巢癌；可以进行手术者；术前均未接受放化疗者。排除标准：妊娠期患者；合并其他系统肿瘤者；无法手术者。另选取同期本院收治的110例上皮性卵巢良性肿瘤患者作为良性组，其中良性浆液性囊腺瘤56例，泡膜细胞瘤20例，黏液性囊腺瘤30例，成熟性畸胎瘤4例。选取本院同期登记的正常健康体检女性110例作为对照组。研究组、良性组和对照组受检者的平均年龄分别为(53.98±10.49)岁、(54.29±11.22)岁、(53.34±1.77)岁；绝经患者分别有61例、70例、66例。三组受检者的年龄和绝经比例比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经安康市妇幼保健院伦理委员会审核批准，所有受检者均知情且自愿签订知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血浆样本采集 抽取受检者清晨空腹静脉血4 mL，放入加有EDTA抗凝剂的EP管中，3 000 r/min离心5 min，取上清备用。

1.2.2 总RNA的提取 将上述血清使用高速离心机14 000 r/min离心5 min，转移上层液体于无RNA酶的EP管中，加入Trizol，混匀；加入氯仿，混匀后室温静置，12 000 r/min离心15 min，吸取上层转移至另一离心管中。加入异丙醇，混匀后室温静置，12 000 r/min离心10 min，倒掉液体，并向EP管中加入75%乙醇，用移液枪轻轻吹打，12 000 r/min离心5 min，倒掉液体。加入DEPC水溶解沉淀物，将样本分为两份，一份采用酶标仪测定浓度，一份用于反转录cDNA。

1.2.3 miRNA逆转录 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录试剂盒完成miRNA的逆转录过程。反应体系：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)(2μL)、Prime Script RT Enzyme MixⅠ(0.5μL)、Gene specific primer(2μmol/L，0.5μL)、Total RNA(0.5μL)和RNase Free dH2O(5μL)，总量为10μL。反转录条件为：16℃30 min，42℃反转录15 min，85℃失活5 s，4℃保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应 根据TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒操作步骤完成。反应体系：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×，12.5μL)、PCR Forward Primer(10μmol/L，1 μL)、PCRReverse Primer(10μmol/L，1μL)、RT反应液(cDNA溶液)(2μL)、灭菌水(8.5μL)，总体系25μL。PCR扩增程序如下：预变性95℃30 s，PCR循环：95℃5 s，60℃30 s，进行40个循环。内参基因为U6，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值的循环数即为Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因－CtU6。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关系数法；多因素分析采用多元Logistic回归模型分析；绘制受检者工作特征曲线(ROC)评价血浆miR-196a及miR-1285对上皮性卵巢癌的诊断价值。均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平比较 三组受检者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；研究组患者血浆miR-196a表达水平明显高于对照组和良性组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中研究组患者的血浆miR-1285表达水平明显低于对照组和良性组，差异有统计学意义(P<0.05)，而良性组和对照组的血浆miR-196a及miR-1285表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 三组受检者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平比较(±s)

表2 三组受检者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP<0.05；与良性组比较，bP<0.05。

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2.2 上皮性卵巢癌患者血浆miR-196a及miR-1285表达水平与临床病理特征的关系 上皮性卵巢癌患者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平与病理分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、病理类型、病理分级、术后是否有肿瘤残余等因素均无关(P>0.05)，见表3。

表3 上皮性卵巢癌患者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平与临床病理特征关系(±s)

表3 上皮性卵巢癌患者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平与临床病理特征关系(±s)

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2.3 血浆miR-196a及miR-1285对上皮性卵巢癌的诊断价值 将研究组定义为1，对照组和良性组定义为0，见图1，采用ROC曲线评估血浆miR-196a及miR-1285表达水平对上皮性卵巢癌患者预后评估的效能。结果显示，上皮性卵巢癌患者血浆miR-196a的Cut off值为1.37，miR-1285的Cut off值为0.81时，上皮性卵巢癌患者血浆miR-196a的AUC及95%CI分别为0.839(0.785~0.894，P<0.001)，miR-1285的AUC及95%CI分别为0.858(0.810~0.905，P<0.001)，提示血浆miR-196a及miR-1285表达水平对上皮性卵巢癌患者诊断具有一定的价值。

图1 血浆miR-196a及miR-1285对上皮性卵巢癌的诊断价值

2.4 血浆miR-196a及miR-1285与上皮性卵巢癌的关系 将研究组和对照组作为二分变量，以血浆miR-196a、miR-1285为自变量，以研究组为1，良性组和对照组为0，采用多元Logistic回归模型对两组数据进行分析。结果如表4所示，血浆miR-196a表达水平的升高是上皮性卵巢癌的独立危险因素(P<0.05)，miR-1285表达水平的降低是上皮性卵巢癌的独立保护因素(P<0.05)。

表4 血浆miR-196a及miR-1285与上皮性卵巢癌的关系

2.5 上皮性卵巢癌血浆miR-196a与miR-1285的相关性 Pearson相关性分析结果显示，血浆miR-196a与miR-1285呈负相关(r=-0.658，P=0.039)。

3 讨论

上皮性卵巢癌是卵巢癌中常见的病理类型，恶性度较高，易发生盆腹腔广泛转移，预后较差[8]。另外卵巢癌位于盆腔深部，早期不易诊断，而中晚期患者手术治疗及放化疗效果不佳，具有较高的死亡率，严重威胁女性生命健康[9]。上皮性卵巢癌多发于绝经后女性，女性绝经年龄约50岁，因此将50岁作为年龄划分节点。

miRNA是高度保守的内源性非编码的RNA分子，在人类生理过程及发育过程中可以调节基因的表达，但同时基因表达的失调在癌症的发生发展过程中也具有重要的作用[10-11]。癌症中miRNA的异常表达具有促进或抑制癌症发展的作用[12]。miR-196a是由HOX家族基因转录而来。研究显示位于不稳定位点的人类miRNAs与肿瘤的发生发展过程具有密切关系，HOX家族的基因即位于不稳定位点，因此miR-196a的表达水平在肿瘤的发生发展也起到关键作用[13-14]。

本研究分别选取上皮性卵巢癌患者、上皮性卵巢良性肿瘤患者及健康者为受检者，研究各组受检者学血浆中miR-196a及miR-1285表达水平的差异，结果显示研究组患者血浆miR-196a表达水平明显高于对照组和良性组，miR-1285表达水平明显低于对照组和良性组，对照组和良性组血浆中miR-196a及miR-1285表达水平组间比较差异无统计学意义。且在病理学分期中，随着分期的增加，患者血浆中miR-196a表达水平显著增加，miR-1285表达水平显著降低，提示上皮性卵巢癌中，miR-196a可能发挥促癌基因的作用，而miR-1285发挥抑癌基因的作用，进而对上皮性卵巢癌的发生发展过程进行调节。以往研究显示miR-196a在多种癌症患者血浆呈现高表达水平，可以通过PI3K/Akt、wnt-βcatenin等通路促进肿瘤生长、转移及侵袭，且会使癌细胞对化疗药物的耐药性增加[15]。miR-1285可表达于多种恶性肿瘤患者，且与癌症的发生发展过程具有密切的关系[16]。沉默的miR-1285对肿瘤抑制因子P53的表达具有促进作用，提示miR-1285可能是肿瘤抑制因子。有文献报道显示卵巢癌患者组织及血浆中miR-1285表达水平与健康受试者比较显著降低，提示miR-1285在卵巢癌的进展过程中具有重要的参与作用，且miR-1285表达水平与患者恶性肿瘤的癌变程度关系密切[17]。

采用ROC曲线分析血浆中miR-196a及miR-1285对上皮性卵巢癌的诊断价值，结果显示，上皮性卵巢癌患者血浆miR-196a的AUC及95%CI分别为0.839(0.785~0.894，P<0.001)，miR-1285的AUC及95%CI分别为0.858(0.810~0.905，P<0.001)，提示血浆miR-196a及miR-1285表达水平对上皮性卵巢癌患者预后评估具有一定的价值。相关性分析结果显示，miR-196a与miR-1285表达水平呈负相关；多元Logistic分析结果显示，miR-196a是上皮性卵巢癌的独立危险因素，miR-1285是上皮性卵巢癌的独立保护因素。提示检测血浆miR-196a及miR-1285表达水平可以提高上皮性卵巢癌早期诊断的准确性，可独立作为上皮性卵巢癌早期诊断的新型肿瘤标志物。文献报道显示miR-1285的表达水平随着卵巢癌恶化程度的增加而降低，提示低表达的miR-1285参与了卵巢癌的进展，可作为卵巢上皮性癌的预后因素。

综上所述，上皮性卵巢癌患者血浆中miR-196a表达水平升高，miR-1285表达水平降低，且miR-196a和miR-1285对上皮性卵巢癌中均具有一定的诊断价值，可独立作为上皮性卵巢癌早期诊断的新型肿瘤标志物。