PI3K/AKT信号通路与骨质疏松关系的研究进展

杨一秋 李兰 赵娜 解继胜 (右江民族医学院,广西 百色 533000)

骨质疏松(OP)是一种常见的骨骼疾病,以降低骨量,破坏骨微结构为特征,最终引起骨骼脆弱并增加骨折风险〔1〕。原发性和继发性是常见的OP 分型。原发性OP 可分为三型,其中Ⅰ型又称为绝经后OP,为高转换型,更年期妇女常见。Ⅱ型又称为老年性OP,为低转换型〔2〕。所谓的高转换型是指破骨细胞活性升高而成骨细胞活性未升高,最终使得溶骨效应增强。低转换型是指破骨细胞活动正常,但成骨细胞成骨能力降低。破骨细胞起着溶骨作用,成骨细胞起着成骨作用,在正常机体中二者是动态平衡的,对于维持正常骨代谢至关重要。磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路广泛参与细胞增殖、分化、存活、代谢等生理过程〔3〕。多项研究〔4～6〕表明PI3K/AKT 信号通路既可以调控成骨细胞又可以调控破骨细胞,对于维持骨组织的稳定发挥了重要作用。本文就PI3K/AKT 信号通路和OP 之间关系的研究进展进行综述。

1 PI3K/AKT 信号通路

PI3K 是一种激酶,磷脂酰肌醇2 磷酸(PIP2)可以被PI3K 磷酸化为PIP3,3 磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)1 和PDK2 可以辅助PI3K 磷酸化AKT 的苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)从而激活AKT〔7〕。活化的AKT 通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如叉头转录因子(Fox)O、糖原合成激酶(GSK)3、B 淋巴细胞瘤-2 基因相关启动子(BAD)、哺乳动物雷帕霉素钯蛋白(mTOR)等调节细胞周期、分化、存活、生长等。PI3K 家族(PI3Ks)几乎表达于所有哺乳动物,人类PI3Ks 根据其结构、调节模式、底物特异性可以被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 类。Ⅰ类PI3Ks 研究最多,通过催化亚基和调节亚基来控制酶的活性。相应的刺激因子和G 蛋白耦联受体、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体、生长因子受体结合后可以激活PI3K 信号通路。Ⅱ类PI3Ks 只有催化亚基而无调节亚基,但其可以作为适配器分子出现在多种蛋白质互作中。Ⅲ类PI3Ks 目前只发现Vsp34 这一个成员,并且在所有真核细胞中都是保守的,主要参与调节空泡转运和自噬〔8〕。

2 OP 与成骨细胞、破骨细胞的关系

破骨细胞的溶骨效应和成骨细胞的成骨能力在骨稳态维持过程中扮演重要角色。成骨细胞或破骨细胞谱系的多种细胞类型组成骨重塑单元。前者包括产生成骨细胞的间充质祖细胞,继而产生骨衬细胞或骨细胞,而后者则包括成熟的破骨细胞及其巨噬细胞前体。骨重塑单元通过将骨吸收与骨形成耦合,协调两种细胞谱系的分化和功能,在维持人骨骼平衡过程中发挥重要作用〔9〕。PI3K/AKT 信号通路在成骨细胞和破骨细胞的生长、分化等方面发挥作用,从而参与OP 的进程。

3 PI3K/AKT 信号通路与成骨细胞、破骨细胞的关系

3.1 PI3K/AKT 信号通路与成骨细胞 研究表明,PI3K/AKT 信号通路可以促进成骨细胞增殖、分化和骨形成从而达到抑制OP 的目的〔6〕。糖皮质激素(GC)是广泛用于治疗炎症或自身免疫性疾病的药物。地塞米松是一种人工合成的GC,通过下调p-PI3K 和p-AKT 的表达来抑制成骨细胞和MC3T3-E1 细胞中PI3K/AKT 信号通路的激活,使得糖原合成酶激酶(GSK)-3β 表达明显上调,最终抑制了细胞的增殖并诱导其凋亡〔10〕。硅是人体必需的微量元素之一,缺乏会导致骨骼疾病。大量动物实验表明,适当增加硅的摄入有助于增强骨密度和韧性,从而预防OP。研究发现原硅酸能够增强PI3K、p-AKT、p-mTOR 及成骨相关标志物——Ⅰ型胶原蛋白的表达。在给予PI3K/AKT/mTOR 通路特异性抑制剂LY294002 之后PI3K、p-AKT、p-mTOR、Runt 相关转录因子(RUNX)2 表达下降,结果表明PI3K/AKT/mTOR 通路在原硅酸介导的体外成骨过程中发挥了积极的调节作用〔11〕。Chen 等〔12〕利用体外皮层切片及小鼠RAW264.7 细胞在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子(NF)-κB 受体活化因子配体(RANKL)的诱导下形成破骨细胞从而建立骨吸收模型,然后用骨吸收上清液(BRS)培养成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1,结果表明BRS 增强了MC3T3-E1 细胞中AKT 和p-AKT 的表达水平,促进了MC3T3-E1 细胞向成骨细胞分化及钙化的面积。白细胞介素(IL)-37 是一种关键的抗炎细胞因子,在多种自身免疫性相关的骨科疾病(包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和OP)中异常表达。研究发现IL-37 可以通过激活PI3K/AKT 信号通路途径增加骨髓间充质干细胞(MSCs)中成骨细胞特异性基因的表达、矿物质沉积数量及碱性磷酸酶的活性,而PI3K/AKT 信号通路抑制剂可以部分逆转由于IL-37 的存在而增强的MSC 的成骨分化〔13〕。

3.2 PI3K/AKT 信号通路与破骨细胞 破骨细胞是一种多核细胞,是骨组织内唯一具有骨吸收功能的细胞。由造血干细胞来源的单核巨噬细胞系在RANKL 和M-CSF 的作用下分化而来〔14〕。M-CSF 和破骨细胞前体细胞上的受体CSF-1R 结合通过激活相关酶如酪氨酸蛋白激酶(Src)、磷脂酶(PL)C-γ、PI3K、AKT 等促进了细胞的增殖和存活〔15〕。RANKL 干预后可以通过激活NF-κB 等多条信号通路从而刺激破骨细胞相关基因的表达,如活化T-细胞核因子(NFATc)1、人类破骨细胞相关受体(OSCAR)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)〔16〕。其中NFATc1 的表达对于破骨细胞生成至关重要,即使没有RANKL 的刺激,NFATc1 在破骨细胞前体细胞中的异位表达也可以促进破骨细胞的生成〔17〕。此外,通过RANKL 刺激缺乏NFATc1 的胚胎干细胞并不能分化为破骨细胞,进一步表明NFATc1 对于破骨细胞的分化起着重要作用〔18〕。

当女性进入绝经期后,由于卵巢功能衰退,雌激素水平低于正常值,破骨细胞溶骨能力增强,导致骨溶解的速度明显超过骨形成,骨量迅速减少,最终导致绝经后OP〔19〕。研究发现,绝经后OP 的发生与雌激素水平的下降和氧化应激(OS)水平的升高息息相关〔20〕。正常情况下通过消除氧自由基如活性氧(ROS)来抵抗氧化作用对机体造成的损伤,但当体内ROS 不断累积时,将导致细胞膜、DNA 损伤,并加快破骨细胞形成,最终导致骨量降低、骨吸收增加〔21〕。ROS 对于调节细胞增殖、存活、代谢、凋亡、分化和迁移是必不可少的。ROS 对于机体具有双重作用,当其充当细胞内信号传导分子时,对机体是有益的,但是当其水平随着年龄或炎症状态的发生而增加时,对机体是有害的〔22〕。研究发现OS 可以促进OP 进程,过量的ROS 可以抑制成骨细胞增殖,诱导成骨细胞凋亡,降低其活性,最终导致骨量降低〔23〕。同时ROS 水平的异常升高使得破骨细胞功能活跃,骨吸收效应增加。

FoxOS 属于叉头框蛋白家族中的一个亚类,其主要在细胞凋亡,DNA 损伤修复和ROS 清除过程中发挥作用〔24〕。Bartell 等〔15〕研究表明,M-CSF 和RANKL 通过激活PI3K/AKT 信号通路,抑制FoxO1的表达减少了抗过氧化物酶等的表达而使得破骨前体细胞中过氧化氢(H2O2)表达升高,进一步刺激破骨细胞的形成和骨吸收。而FoxO1 可以激活一些抗氧化酶基因的表达如:谷胱甘肽过氧化酶、H2O2酶和超氧化物歧化酶来抵抗H2O2对破骨细胞的促进作用,在OP 中发挥保护作用。白藜芦醇(RES)是一种多酚植物雌激素,具有增强免疫力、抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多重功效〔25〕。冯燕陵〔26〕研究发现,RES、葛根素可以通过抑制PI3K/AKT 信号通路,上调FoxO1 蛋白的表达水平和转录水平通过促进抗氧化物基因的表达降低由OVX 诱导的RANKL的异常升高,上调OPG 的表达,进而抑制破骨细胞的生成、活性和骨吸收能力。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁产物,可以刺激机体产生诸如肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、前列腺素(PG)E2 等炎症因子促进破骨细胞分化,在骨溶解性疾病中发挥重要作用,葛根素是葛根的主要活性成分,是一种植物雌激素,有雌激素样活性,可以通过抑制AKT ser473、AKT thr308 位点的磷酸化活化从而抑制LPS 诱导的破骨细胞形成、功能和骨丢失〔27〕。

第10 号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)和张力蛋白同源基因与SHIP 都是PI3K/AKT 信号通路的负性调节器,PTEN 是一种具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因,其N 端具有脂质磷酸酶活性可以使PIP3 脱磷酸,减少PIP3 的生成,从而达到抑制PI3K/AKT 信号通路的目的,并且进一步抑制细胞的生长并促进细胞死亡。其C 端具有不同的丝/苏氨酸磷酸化位点(T366、S362、S370、S380、T382、T383、S385)可以被不同的激酶磷酸化,使其失去对PIP3 的去磷酸作用,导致PTEN 抑制PI3K/AKT 信号通路的功能失活〔28〕。PI3K 在RANKL 诱导的破骨细胞生成中发挥重要作用,意味着PTEN 也可以调节破骨细胞的功能。所以当RAW264.7 细胞过表达PTEN 时,下调了磷酸化的AKT、BAD、NF-κB抑制因子(IκB)a,同时也减低了NF-κB 的表达并导致RAW264.7 细胞凋亡增多,破骨细胞生成减少〔29〕。SHIP 是一种Src 同源2-肌醇-5 磷酸酶,广泛表达于造血细胞,可以水解PIP3 的5 位磷酸,负性调节PI3K/AKT 信号通路〔30〕。研究表明在SHIP 敲除的小鼠体内,通过激活AKT/GSK-3β/NFATc1 信号通路,促进NFATc1 的核定位,使得破骨细胞生成增多〔31〕。梓醇通过抑制Iκb、AKT、GSK3β 的磷酸化及P65 的磷酸化和核转位以剂量依赖性的方式抑制RANKL 诱导的破骨细胞生成过程中NFATc1、c-fos、ctsk、trap 蛋白的表达,然而丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38 蛋白的磷酸化水平并不会被梓醇影响。RANKL 可以使磷酸化的PTEN 蛋白下降,但不会改变总PTEN 的蛋白水平,而梓醇干预后可以逆转磷酸化PTEN 蛋白的下降趋势,同时上调总PTEN 的蛋白表达水平。进一步研究发现,梓醇通过抑制PTEN 的泛素化降解上调PTEN 蛋白的活性,从而导致破骨细胞生成减少〔32〕。在RANKL 诱导的破骨细胞分化过程中,由于GSK-3β功能的钝化使得磷酸化的PTEN 逐渐减少,最终导致PTEN 对PI3K/AKT 信号通路的抑制作用也减少,提示PTEN 磷酸化水平越低越有利于破骨细胞的分化〔33〕。

GSK-3 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可以被AKT激酶磷酸化失活。最初是研究其在糖原沉积中的调节作用,被认为是糖原代谢的关键酶〔34〕。GSK-3 有GSK-3α 和GSK-3β 两种亚型。其参与许多生物学进程,如新陈代谢、转录、翻译、细胞生长及细胞凋亡等〔35〕。GSK-3 可以调节多种转录因子,包括周期蛋白(cyclin)D1、c-Jun、NFATc 及β-catenin。GSK-3α的丝氨酸残基ser-21 和GSK-3β 的丝氨酸残基ser-9可以被多种激酶通过磷酸化途径抑制,进而抑制了GSK-3 的活性。GSK-3 丝氨酸磷酸化抑制了GSK-3磷酸化底物的能力〔36〕。GSK-3β 可以磷酸化NFATc1 从而调节NFATc1 的亚细胞定位,进一步在破骨细胞分化中发挥作用〔37〕。研究表明,GSK-3β通过调节NFATc1 的表达,来抑制破骨细胞的生成。同时发现RNAKL 刺激破骨细胞前体产生破骨细胞的过程中,GSK-3β 的ser-9 被磷酸化使得GSK-3β活性被抑制。GSK-3β 活性持续表达的GSK-3β-S9A转基因小鼠体内,NFATc1 和破骨细胞生成基因表达受损,使得小鼠出现严重的骨硬化表型〔35〕。也就是说GSK-3β 是RANKL 诱导的破骨细胞生成过程中的负性调节物。

综上,OP 是一种与年龄密切相关的骨骼疾病。最严重的后果是骨折,常见部位是:椎体、髋部、前臂远端、肱骨近端和骨盆等。OP 性骨折危害巨大,给老年患者的生活带来巨大痛苦并且对于家庭和社会来说也是一个沉重的负担。临床现有的治疗方法有一定的局限性,并且存在一些不良反应。如双磷酸盐是目前临床上应用最为广泛的抗OP 药物,与骨骼羟磷灰石有较高的亲和力,能够结合到骨重建活跃的骨表面,抑制破骨细胞骨吸收功能从而抑制骨破坏。但依然存在一些问题,包括胃肠道不良反应、一过性“流感样”症状、肾脏毒性及下颌骨坏死等〔38〕。降钙素类药物,如鳗鱼降钙素类似物和鲑降钙素,总体来看药物安全性较好,但少数患者使用后出现面部潮红、恶心、过敏等不良反应。雌激素治疗法能减少骨丢失,降低OP 骨折发生率,但增加了患子宫内膜癌、乳腺癌、心血管疾病等的风险。PI3K/AKT 信号通路是OP 发病机制中重要组成部分,从分子角度提出了一种新的OP 治疗方案及相关治疗靶点,对于新药研发有积极的促进作用。