针刺联合补脾强力方治疗对自身免疫性重症肌无力的免疫调控

王晓玲，范晓艳，赵鹏涛，曾天文

(1.渭南市中心医院,陕西 渭南 714000；2.陕西省康复医院，陕西 西安 710065)

重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是一种以神经肌肉接头传递功能障碍为特征的自身免疫性疾病，与乙酰胆碱受体(AchR)结合的抗体引起补体级联激活和突触后膜破坏，导致神经肌肉接头AChR的丢失，产生依赖T细胞的抗体的发展，进而导致耐受机制的崩溃以及骨骼肌无力和疲劳的临床表现[1]。MG的常用治疗方法包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、皮质类固醇和免疫抑制剂、静脉免疫球蛋白(IVIG)或血浆置换等[2]。但仍有1/3的患者经历了MG的加重，对标准治疗的反应很差，与疾病和治疗相关的发病率仍然很高[3]。辅助性T细胞(T follicular helper cells，TFH)及以CD4+CD25+FoxP3+细胞为特征的T调节细胞(T-regulatorycells，Tregs)是参与体液免疫反应的主要T细胞亚群，在自身免疫性疾病中起着关键作用[4]。因此，重点评价Treg缺陷或功能障碍在MG相关自身免疫病理中的作用，可能为一种潜在的治疗策略。

补充替代医学因其远期疗效好、副作用少等优点，越来越多地被用于治疗MG，针灸是最常用的补充医学形式之一[5]。如今，越来越多的MG患者向补充医学和替代医学寻求帮助。针灸作为中医的重要组成部分，长期以来一直被用于治疗MG疾病，可以缓解患者的症状[6]。然而，目前尚无系统评价针刺治疗MG的机制。而中医具有补脾益损、升阳举陷治法，在患有自身免疫性疾病的患者中，由于中医药具有有效、廉价且相对安全的特性致使用率上升[7]。补脾强力方由黄芪、党参、苍术、土茯苓、陈皮、丹参、淫羊藿、锁阳、生地和制附片组成，具有补脾养肾兼以养肝的效果[8]。鉴于针刺治疗自身免疫性疾病的研究现状及补脾强力方的特性，本研究旨在评价针刺联合补脾强力方对自身免疫性MG的免疫调控作用，为MG的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SD雄性大鼠40只，体质量(240±10)g，8周龄，购于成都达硕实验动物有限公司，使用许可证号：SYXK(川)2018-119，生产许可证号：SCXK(川)2019-031。大鼠饲养于恒温(20～25 ℃)、恒湿(50%±5%)、自然采光和自由饮水条件下，符合《实验动物管理条例》要求。

1.2 药物与仪器

大鼠AChR97-116肽购自中国上海中肽有限公司；补脾强力方(黄芪6.6 g，党参6 g，苍术2.2 g，土茯苓4 g，陈皮2 g，丹参3.6 g，淫羊藿1.5 g，锁阳2.2 g，生地4 g，制附片3.5 g)，中药配方颗粒，由广东一方制药有限公司生产，取相应剂量，加入10倍量的水，浸泡8 h后煮沸，提取5 h，将药液过滤去渣，滤液浓缩至生药含量为1.5 g/mL；IgG(批号：ZC-37002)、IgA(批号：ZC-37000)、IgM(批号：ZC-37006)、IFN-γ(批号：ZC-36294)及IL-18(批号：ZC-36389)试剂盒购自上海茁彩生物公司；FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司)；TRIzol试剂RNA提取试剂盒(批号：14105)购买自Invitrogen公司(卡尔斯巴德，美国)；PCR扩增试剂盒(批号：AK9906)购买自TaKaRa公司(日本)；CD19(批号：sc-373897)、CD4(批号：sc-19641)相关抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司(美国)。

1.3 分组与造模

大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、补脾强力方组、针刺治疗组和针刺联合补脾强力方组。通过免疫乳剂的制备构建实验动物模型[7]：首先将鼠源性AchR-α亚基97-116肽段序列(R97-116)、完全弗氏佐剂(CFA)和磷酸缓冲液(PBS)三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混匀制成免疫乳剂；首次免疫：取乳剂200 μL(含R97-116：100 μg)于造模鼠足垫、腹部和背部多点皮下注射，空白组皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，将R97-116、不完全弗氏佐剂(IFA)和PBS三者按1∶3∶3的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 μL(含R97-116：50 μg)加强免疫，空白组注射等量PBS。3次免疫结束后对大鼠进行肌力评分，按Lennon[9]症状分级评分法对大鼠的肌无力症状进行评定，评分标准为0级：正常肌力；1级：撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地而上前肢打滑，活动减少且易疲劳；2级：明显无力，体息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳；3级：严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震，呼吸困难，濒死或死亡。当Lennon症状分级评分≥1级，则判定大鼠模型复制成功。

1.4 治疗方法

1.4.1 空白组、模型组 相同条件下饲养，每日抓取，不予其他干预。

1.4.2 补脾强力方组 每日以10 g/kg补脾强力方灌胃。

1.4.3 针刺治疗组 将大鼠固定于柔软型大鼠固定器上，选取大鼠的手三里、足三里、脾俞和肾俞；除手三里穴直刺5 mm外，其余穴位均直刺6 mm，针刺后行平补平泻手法，使针下沉紧，操作结束后在针上加高约1 cm的艾炷，连续灸3壮，并留针30 min，每日操作1次。穴位定位参照《大鼠穴位图谱的研制》以及李忠仁版的《实验针灸学》[10]。

1.4.4 针刺联合补脾强力方组 灌胃补脾强力方+针刺治疗，持续治疗21 d。补脾强力方根据临床成人剂量换算动物临床等效剂量为10 g/kg，使用时以蒸馏水配制成所需浓度。

1.5 大鼠肌力评分

大鼠肌力评分，通过重复抓握练习进行检测以及将大鼠放置在平台上观察其是否有无力的表现进行临床评分[11]：0分：力量正常，无异常；1分：轻度活动减少，握力或哭声较弱，运动结束时更明显；2分：运动前出现临床体征(震颤，头朝下，驼背，握力弱)；3分：运动前出现严重临床体征，无握力，奄奄一息；4分：运动结束时出现临床体征(震颤，头朝下，驼背，握力较弱)。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 流式细胞检测CD3+、CD4+和CD8+含量 取抗凝血100 μL加入流式测定管中，分别加入5 μL APC标记的CD3 McAb及5 μL FITC标记的CD4 McAb、5 μL PE标记的CD8 McAb后混匀，避光孵育约20 min，加2 mL溶血素，避光孵育约10 min，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，加PBS洗2遍，弃上清液，加入PBS缓冲液，调整细胞浓度至1×106个细胞/mL，于FACSCalibur 流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+水平。

1.6.2 ELISA检测血清因子 腹主动脉采血3 mL，分离血清，按照ELISA试剂盒说明检测血清IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平。

1.6.3 qRT-PCR检测胸腺组织IL-10、FOXP3 mRNA表达 处死大鼠，取胸腺组织，TRIzol®试剂提取样本总RNA，RT试剂盒反转录。严格按照逆转录试剂盒和相关引物的说明书加入相应量的试剂进行聚合酶链反应，GAPDH作为内参。引物序列：IL-10：上游5′-GCTCAGCACTGCTATGTTGC-3′，下游5′-TGTTGTCC AGCTGGTCCTTC-3′；Foxp3：上游5′-CACCTATGCCACCCTTATCCG-3′，下游5′-CATGCGAGTAAACCAATGGTAGA-3′；GAPDH：上游5′-AGGTCGGTGAAC GGATTTG-3′，下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。记录CT值，采用2-ΔΔCT法分析mRNA相对表达水平。

1.6.4 WB检测胸腺组织CD19、CD4蛋白表达 取胸腺组织，RIPA裂解液提取样本总蛋白，BCA进行蛋白质定量，SDS-PAGE分离，PVDF转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，按照实验目的结合一抗CD19、CD4和β-catin4 ℃孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室显色，Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，阴性对照组目标蛋白质相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量，实验重复3次。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠肌力评分比较

与空白组比较，模型组肌力评分明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，与模型组比较，补脾强力方组、针刺治疗组和联合治疗组的肌力评分均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠肌力评分比较

2.2 各组大鼠CD3+、CD4+及CD8+水平比较

与空白组比较，模型组CD3+、CD4+水平明显升高，CD8+水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，联合治疗组可明显降低CD3+水平，补脾强力方组、针刺治疗组可明显降低CD4+水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，补脾强力方组、针刺治疗组和联合治疗组CD8+水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠CD3+、CD4+及CD8+水平

2.3 各组大鼠IgG、IgA、IgM及IFN-γ、IL-18水平比较

与空白组比较，模型组IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，仅联合治疗组可明显降低IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠IgG、IgA、IgM及IFN-γ、IL-18水平

2.4 各组大鼠胸腺组织CD19、CD4蛋白表达比较

与空白组比较，模型组CD19、CD4蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，补脾强力方组、针刺治疗组和联合治疗组可明显降低CD19、CD4蛋白表达，联合治疗组效果较佳，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4、图2。

表4 各组大鼠胸腺组织CD19、CD4的蛋白表达

2.5 各组大鼠胸腺组织IL-10、FOXP3 mRNA表达

与空白组比较，模型组IL-10 mRNA表达明显升高，FOXP3 mRNA表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，仅联合治疗组可明显降低IL-10 mRNA表达，明显升高FOXP3 mRNA表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5、图3。

表5 各组大鼠胸腺组织IL-10、FOXP3 mRNA表达

3 讨论

MG是一种具有复杂发病机制的获得性自身免疫性疾病，研究显示MG主要由致病性抗AChR-Ab引起[1]。在病理条件下，激活的Th细胞分泌多种细胞因子，进而刺激B细胞增殖、分化并分泌补体结合的抗乙酰胆碱受体，最终触发膜攻击复合物的形成，破坏神经肌肉接头突触后膜。因此，AChR表达的减少阻碍了神经递质乙酰胆碱有效传递到适当的细胞[12]。故本实验通过AChR97-116肽构建自身免疫性MG大鼠模型，评价针刺联合补脾强力方治疗对自身免疫性MG大鼠的免疫调控作用。

研究证实CD4+T细胞在MG患者的发病机制中起重要作用，活化的CD4+T细胞与合成低亲和力抗AChR-Ab的B细胞相互作用，触发IgG基因的体细胞突变，从而诱导产生高亲和力的抗AChR-Ab，AChR特异性的CD4+T细胞主要存在于MG患者的胸腺中，许多MG患者在胸腺切除或抗CD4+T细胞治疗后肌肉无力得到缓解[13]。此外，动物实验表明CD4+T细胞功能缺陷的小鼠不能诱发EAMG，分化后的CD4+T细胞可根据其分泌的细胞因子分为不同的亚群，Th1主要分泌促炎症细胞因子，促进补体结合免疫球蛋白的分泌；Th2主要分泌IL-4和IL-10，可以诱导B细胞增殖和分化，促进抗体分泌[14]。CD3+可参与T细胞识别抗原和传递信号，而CD8+具有抑制B细胞生成抗体及降低T细胞活性等作用，从而抑制体液和细胞免疫[15]。本研究结果表明MG大鼠外周血CD3+CD4+T细胞比例明显高于空白组，CD8+水平明显低于空白组；而补脾强力方组、针刺治疗组可明显降低CD4+水平；MG大鼠IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平较空白组明显升高；针刺联合补脾强力方治疗可明显降低IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平。提示CD3+CD4+T细胞参与MG发病，针刺联合补脾强力方治疗可有效缓解这一进展。

研究报道MG病情严重程度与外周血淋巴细胞中CD4+CD25+GITR+Tregs比例降低呈正相关[16]。然而一些研究显示MG患者中没有CD4+CD25+Treg功能障碍[17]。此外，MG患者存在CD4+CD25+CD127Tregs抑制缺陷，这与IL-6、IL-10、IL-17及IFN-γ水平变化有关，自身抗体依赖机制被认为是各种自身免疫性疾病的重要原因，致病性自身抗体直接或以免疫复合物的形式作用于自身抗原，导致疾病的发生[18]。CD19通过可影响B淋巴细胞的活化和分化，CD19缺陷会导致体液反应受损，总体上增加感染的易感性，在单次注射抗CD19单抗两周后，小鼠中的大多数成熟B细胞被耗尽，血清IgM、IgG和IgA抗体水平显著降低[19]。本研究发现模型组CD4、CD19蛋白及IL-10 mRNA表达明显升高，而FOXP3 mRNA表达明显降低；补脾强力方组、针刺治疗组和联合治疗组可明显降低CD19、CD4蛋白表达，且联合治疗组效果明显。此外，IL-10还作为一种多效性细胞因子，促进炎症和自身免疫的发展。提示CD19、CD4及IL-10在MG发病机制中的重要作用。此外，对于重症肌无力的诊断和治疗，仍然需要长期甚至终生的治疗。本研究实验表明针刺联合补脾强力方可以缓解MG的症状，针刺联合补脾强力方从中医的整体观念出发，抓住MG的病机关键，对MG具有良好的治疗作用，且中医治疗可进行长期有效治疗，产生的副作用较小。由此，将针刺结合中医药作为MG的治疗方法之一，能够有效提高MG的治疗水平。

综上所述，针刺联合补脾强力方治疗可明显降低自身免疫性重症肌无力大鼠CD3+CD4+T细胞及CD19水平，降低免疫球蛋白的分泌，对重症肌无力具有明显改善作用。