淋巴细胞靶向治疗在系统性红斑狼疮中现状与未来

杨卓轩李清群彭志元石 彬

(1.遵义医科大学附属医院,贵州 遵义 563000;2.遵义医科大学检验医学院,贵州 遵义 563000)

0 引言

SLE是一种伴有严重器官损害的具有异质性的自身免疫性疾病,其引起多系统脏器受累的主要原因是自身抗原暴露、自身抗体产生、慢性炎症和组织损伤相互作用引起的恶性循环[1]。SLE 发病机制复杂,一般认为是因机体的免疫调节功能受损和正常的自身免疫耐受被打破,导致多种自身抗原成为靶抗原,使得自身反应性的B 细胞产生的多种自身抗体与自身抗原结合形成免疫复合物,进而引起多种器官和组织的损伤[2]。在疾病发展的不同阶段,可以观察到免疫系统各种组分的失调,但B 细胞活动过度导致产生过量的多种自身抗体是SLE的主要免疫学标志之一[3],即B细胞活动过度是引起过量自身抗体产生的主要原因,是SLE疾病进展中的关键环节,进一步可形成免疫复合物。免疫复合物在器官如肾中的沉积通过激活补体系统和炎性细胞聚集导致机体产生随后的炎症,也就是说,自身抗体的存在是狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)发展的绝对先决条件[4],其中主要的致病性自身抗体由器官局部的浆细胞产生,这种细胞寄居于SLE患者的肾脏[5],因此,B细胞和及其衍生细胞(浆细胞)被认为是参与SLE 发病的主要细胞,并且有学者观察到SLE患者血液中浆细胞前体的高频率存在,这可支持此种观点[6]。同时,Choi JY 等人[7]的研究也表明SLE患者中循环浆细胞的增加与疾病活动相关。T 细胞在SLE发病机制中也起到了重要作用,可通过分泌促炎细胞因子来放大炎症,辅助B细胞产生自身抗体,并促进疾病的记忆T 细胞的积累[8]。T 细胞表达和功能的许多畸变已被发现与SLE 患者体内异常T 细胞活化有关[9],这导致T 细胞受体(T cell Receptor,TCR)活化阈值降低和外周耐受性降低。

此外,SLE是一种高度异质性的疾病,其遗传性危险因子具有高度多样性。因此,即使患者临床表现相似,但其在病理生理学方面也存在显著的区别。正是这些差异导致目前很多生物技术药物的临床试验无法到达终点。SLE的传统激素治疗、免疫抑制剂治疗和免疫吸附治疗存在的缺点是不能识别机体的正常细胞和自身反应性细胞,因此导致了很多不良反应,使其在临床治疗中的应用需慎重。而免疫细胞靶向治疗为临床工作提供了新的思路,而且目前在临床诊疗中得到了广泛的应用,且取得了一定的成效。但是,因其在治疗过程中存在用药剂量大、费用高、疗效不稳定、感染率高等缺陷,目前免疫靶向药物在临床中的使用也受到了限制。

在过去的40年里SLE的预后得到了明显改善,但对疾病致病机制的更加深入的理解仍然是开发更有效的特异性靶向治疗的关键。免疫细胞靶向药物的出现,引导今后的研究方向可以转向精准治疗。新一代的自身免疫性疾病的治疗策略应更精准,更具有靶向性,在阻断疾病进展、防止疾病爆发及减少并发症的同时,还能够维持机体正常的免疫应答,并且减少对于其他非病变累及器官的损伤以及维持内环境的稳态。

1 目前应用于临床的免疫细胞靶向治疗

近年来,随着对SLE发病机制的深入研究,靶向治疗药物作为治疗SLE 的新型药物,在临床应用展示出良好的前景。SLE的传统治疗(包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒药物和免疫吸附疗法)都是非特异性的,当药物在机体内发挥作用的时候无法区分正常的细胞和自身反应性细胞,导致对机体造成严重的不良反应。相比之下,靶向治疗药物在SLE治疗中具有较好的安全性及临床疗效。目前靶向治疗的主要靶点有特异性自身免疫抗体、异常激活的T、B 淋巴细胞、浆细胞、干扰素等(图1)。

图1 目前B细胞、浆细胞、T 细胞以及干扰素靶向治疗药物及其靶点

1.1 B细胞靶向治疗

随着对于疾病的深入研究,B细胞在SLE发病机制中的核心作用得到了突出重视,这是因为B 细胞的抗体依赖(产生的自身抗体并通过多种机制参与自身免疫)和非依赖机制(抗原提呈、T 细胞激活和极化、以及树突状细胞的调节)在SLE致病中均发挥了重要作用[10]。目前针对B细胞的生物疗法中较为有效的是B细胞耗竭疗法。B细胞耗竭疗法是指消除大多数B 细胞或仅消除部分B 细胞群[11]。这些药物主要通过两种机制实现B细胞耗竭:第一,通过针对B细胞表面分子CD19,CD20(利妥昔单抗(Rituximab)和奥伐木单抗(Ofatumumab)靶点)和CD22(埃普拉图珠单抗(Epratuzumab)靶点)的单克隆抗体直接杀伤B 细胞;第二,抑制B淋巴细胞刺激因子BlyS(贝利木单抗(Belimumab)靶点)和APRIL(阿塞西普(Atacicept)靶点)造成的破坏[12]。最广泛杀死B细胞的抗B 细胞药物是抗CD20抗体,它会引起广泛的B 细胞耗竭。Rituximab就是一种针对CD20人-鼠嵌合单克隆抗体,可以特异性地耗尽B细胞,并且能降低疾病活动性和血清自身抗体[13]。尽管Rituximab在LN 和非LN 临床试验中均尚未达到终点[14,15],但是一些研究表明Rituximab对于治疗难治性SLE 是有效[16-18]。欧洲风湿病联盟(European League Against Rheumatism,EULAR)提出,Rituximab可用于治疗造成器官损伤的难治性狼疮[19]。因此,Rituximab在临床中的具体应用尚需大量实验来验证,目前尚不能武断做出结论其对于治疗SLE 是否有效。Belimumab则可通过抑制BlyS活性而显著降低B细胞活性[20,21]。作为第一种批准用于治疗非肾性SLE 的生物制剂,Belimumab可能能够更有效地诱导低疾病活动和临床缓解[22,23]。其安全性和有效性已在许多临床试验中得到证实[24-26]。最近,一项双盲对照试验评估了Belimumab在活动性SLE 患儿中的疗效和安全性[27]。目前正在进行的两项大型临床试验,BLISS-FERED[28]和BEAT[29]正在评估Rituximab和Belimumab联合应用的疗效。进行这两项临床试验的依据是研究人员在临床实验中发现Rituximab治疗后患者体内的BlyS水平增加,其可能有助于自身反应性B细胞的存活和反弹以及随后的疾病爆发;而Belimumab作为一种重组IgG1λ人类单克隆抗体,可结合并拮抗可溶性BlyS的生物活性;因此,专家们认为当二者一起使用时,可通过互补机制导致循环和组织中残留的自身反应性B淋巴细胞的进一步耗竭[28]。

Epratuzumab可降低外周血靶细胞中B细胞的活性和B细胞的数量,其可能会成为SLE临床治疗的突破口[30]。最近,一种新的BAFF(B细胞活化因子)抑制剂Blisibimod已经进行了Ⅲ期临床试验,结果显示使用Blisibimod的SLE患者的自身抗体和B细胞数量减少,补体C3和C4增加,同时患者在后期治疗中使用的糖皮质激素的剂量有所减少[31]。然而,Epratuzumab和Blisibimod均未能在临床试验中达到其主要终点[31,32]。同时,Belimumab以外的其他B细胞靶向药物的安全性和有效性存在争议,需要在未来的实验中得到证实。

目前,B细胞耗竭相关靶向药物主要用于重症患者,但是在使用过程中,仍需要临床医师们根据患者的种族,器官的损伤程度等条件来进行个体化治疗。并且由于该疗法用药量大、费用高、疗效不稳定、感染率高等缺陷其在临床使用中仍受到限制。

1.2 浆细胞靶向治疗

SLE相关的自身抗体由浆细胞分泌,有效地消耗自身反应性浆细胞(Antibody secreting cells,ASCs)可能是治疗该疾病的关键。浆细胞的种类有两类,包括新产生的增殖浆细胞(proliferating plasma blasts PBs)和不能增殖的长寿浆细胞(non-proliferating long-lived plasma cells,PCs),其中PCs有助于自身抗体的产生,这就是浆细胞能引起SLE的关键所在[33,34]。由于PCs对常规免疫抑制或以B细胞为靶点的治疗耐受[35],现有的治疗致病性PCs的方法(如蛋白酶抑制剂和抗胸腺细胞球蛋白,及针对靶向生存因子、细胞归巢或表面分子等的新型疗法)致力于耗尽整个储存池的细胞,然而,在耗竭的细胞中也包括对正常浆细胞和分泌保护性抗体的浆细胞的杀伤[36]。其中,蛋白酶抑制剂(硼替佐米)是一种很有效的药物,其通过免疫球蛋白链积聚,导致压倒性的内质网压力和末端展开的蛋白质反应,致使细胞凋亡[35],这有望提高血浆细胞耗竭的效率。研究者们在小鼠自身免疫模型中发现,蛋白酶体抑制剂使小鼠体内的浆细胞几乎完全耗竭,且阻止了狼疮肾等器官的进一步损伤,然而在人体内蛋白酶体抑制剂对浆细胞的耗竭作用却远不如小鼠[36]。在Alexander S等[37]的研究中,硼替佐米(Bortezomib)可以治疗性的引起SLE患者体内的PBs和PCs的消耗。同时发现在与B细胞靶向治疗药物(如Rituximab)联合应用时,还可以防止PBs和PCs的再生。目前,Bortezomib在治疗难治性SLE的安全性和有效性均已在临床试验中得到证实[38,39]。此外,在van Dam LS等人[40]的研究中,Rituximab及Belimumab的联合应用可以显著降低抗C1q抗体(其与疾病活动性有关)。CD38分子在浆细胞表面高表达[41],这可以抑制促炎症细胞因子的合成,从而调控SLE的发病[42]。因此,目前其他有希望的治疗策略集中在对浆细胞表面高表达的CD38分子的表达进行干预,对有助于浆细胞归巢的因素进行诱导以及调控外周血浆细胞存活的基因[36]。

浆细胞治疗目前存在的最明显的缺陷就是缺乏选择特异性,这是导致治疗疾病时产生较大不良反应的主要原因。此外,由于SLE患者在B细胞和浆细胞稳态方面表现出显著的异质性,B 细胞的生物耗竭疗法对B细胞和浆细胞治疗的影响有待研究人员们通过大量的基础及临床实验来确定。

1.3 T细胞靶向治疗

T 细胞在SLE的发生、发展过程中起着重要的作用,滤泡辅助性T 细胞(T-follicular helper cells Tfh)可通过调节B细胞的克隆选择,为B细胞提供免疫球蛋白产生、同型转换和细胞超突变的信号,从而起到激活和分化B细胞的关键作用[3]。即活化后的Th细胞表达CD40配体,与B细胞表面CD40相互作用,向B细胞传达重要的第二活化信息,在第一、第二活化信号和Th细胞产生的细胞因子作用下,B淋巴细胞活化、增生与分化产生特异性抗体。已有研究发现在SLE 患者外周血中Tfh细胞的明显增加[43,44],且在小鼠模型中发现Tfh细胞失调与SLE的发展相关联[45]。研究发现,自身反应性T 细胞[46]、CD4＋T 辅助细胞和CD3＋CD4－CD8-T 细胞在SLE患者体内T 细胞中所占的比例均升高,它们均有助于自身抗体的产生[47]。目前针对T 细胞信号途径的药物,如CTLA4-Ig融合蛋白阿巴西普(Abatacept),其通过抑制T 细胞共刺激因子来抑制T 细胞活化[48]。在对LN 炎患者进行Ⅱ/Ⅲ期临床实验时,接受过Abatacept治疗的患者的抗双链DNA(抗dsDNA)抗体、补体C3和补体C4等指标的好转情况要优于对照组,但在不良反应及其严重程度等方面与对照组治疗后的结果相当[48]。

Toll-7样受体(toll like receptor 7,TLR7)激动剂咪喹莫特能够通过抑制Tfh细胞的分化来阻止MRL/lpr小鼠SLE的进展[49]。此外,Chu.Y 等人[50]发现单独使用雷帕霉素或与全反式维甲酸联合使用可降低SLE患者的疾病活动,且可以降低临床治疗中对糖皮质激素的需求,这可能是Th17/Treg细胞平衡调节的结果。

Jang SG 等人[51]在最新的研究中发现抗蠕虫药物氯硝柳胺可以通过抑制STAT3信号通路来抑制Th细胞和浆细胞。这说明部分抗寄生虫类药物亦可用于SLE的治疗,但是否存在可靠的治疗效果还需要更多的动物实验及临床研究来验证。

1.4 干扰素靶向治疗

针对调节T 细胞的细胞因子治疗有很多种,目前临床应用较为广泛的药物就是干扰素抑制剂。IFN-α是I型干扰素家族成员之一,其可通过抗原提呈细胞打破免疫耐受,能促进各种免疫细胞的刺激和分化(包括自身反应性B细胞向浆细胞的分化),能调节T 细胞共刺激分子的上调和导致调节性T 细胞(Tregs)的失活[52-55]。目前已经有大量数据表明IFN-α参与了SLE的发病机制[56]。有研究表明I型IFN 在外周血中的含量与SLE患者的SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分和外周血中抗dsDNA 浓度呈正相关[57]。此外,I型干扰素驱动的基因信号(Ifngs)的表达与疾病活动有关[58]。其主要代表药物阿斯利康(Anifrolumab)是一种全人IgG 1κ单克隆抗体,可结合并中和IFN-α受体,从而阻断I型IFN 依赖性细胞信号传导[58]。目前此种药物的Ⅱ期临床试验疗效显示:部分SLE 患者皮疹、脱发和关节等症状较对照组明显改善[59]。Chatham WW 等人[60]在研究中同样发现,阿夫土珠单抗治疗效果和安全性与疾病活动性相关。也有文章报道,应用糖皮质激素的基础上联合注射INF-γ或INF-α均可对T 细胞的功能以及表达CD3和CD4的细胞数量产生影响[61]。目前的研究主要集中在INF-α,对于其他干扰素的研究较少,是否其对于治疗SLE 是否有效仍有待进一步探究。

在T 细胞及其细胞因子的治疗正在临床研究过程中,实验结果表明使用这些药物确实能使患者的症状得到改善,但是不良反应较对照组相比并没有什么优势,甚至比对照组更严重[62],因此,对于T 细胞靶向治疗药物的探究还需要投入更多的时间和经济成本,才有可能找到对SLE 治疗有显著效果且不良反应的药物。

2 潜在的精准治疗靶点

近几年,虽然SLE在基础和临床等方面的研究均有重大突破,但至今仍缺乏疾病特异性及无不良反应的治疗药物[2,63-65]。SLE的高度异质性致使针对SLE传统疗法及药物无法适用于每一个患者。因此,发展个性化靶向药物或补充治疗药物在突破传统SLE 治疗方案中具有相当大的潜力。而当前最大的难题是尚未找到有效的治疗靶标、确定常见的致病途径以及异常细胞活性与疾病活动相关的生物标志物(图2)。

图2 B细胞和Th细胞群的SLE潜在治疗靶点

2.1 B细胞和浆细胞

B细胞不仅产生致病性自身抗体,而且可通过产生细胞因子和趋化因子来调节免疫应答,以此来表明B细胞的功能和信号传递的异常[66]。有研究发现,BLK、BANK1和LYN 基因变异可能通过改变B细胞受体信号而增加SLE的易感性[67-70]。还有研究发现,IRF8、ETS1、IKZF1、AFF1、RasGRP3、PRDM1、FcγRIIB、PRKCB和NCF2等不仅是B细胞发育、分化、增殖和活化的主要分子,而且还含有与SLE 易感性相关的多态性基因[67,68,71-73]。HLA-DR2&DR3基因(具有改变产生抗体的能力)、IL-10(抑制T 细胞和抗原提呈细胞,增强B细胞的存活和活性)和IL-21(促进抗体类转换和维持自身抗体的产生)也含有与SLE相关的多态性基因[67,68]。在该领域通过对B细胞遗传基因研究的开展,帮助临床确定那些最严重形式的SLE 遗传以及起协同作用的基因组、表观遗传,也可以帮助为高危风险个体的靶向治疗提供最适当的治疗途径和见解。ARID3a,最初被发现是作为一种免疫球蛋白(Ig)重链转录的B 细胞调节因子,即能促进Ig重链的转录,并与内含子重链增强子结合,其表达与B 细胞自身抗体的产生相关[74]。另外,Bhamidipati K 等人[75]提出,SLE患者B细胞上CD52表达的增加可以抑制B细胞功能亢进。综上所述,ARID3a和CD52也可作为治疗SLE的潜在靶点。

浆细胞在正常生理情况下负责产生具有抗感染等作用的保护性抗体,但它们也在自身免疫性疾病如SLE等疾病中产生致病性抗体。自身反应性浆细胞具有记忆的特性,但是在目前治疗中没有受到人们足够的重视。在制定新的治疗策略时应考虑到这一问题。传统上认为,高亲和力的IgG 自身抗体是通过生发中心(germinal center,GC)产生的,然而,发生在滤泡外的体细胞高突变和类别转换可能也与SLE 的致病有关。虽然滤泡外(extrafollicular,EF)和GC途径都能导致自身抗体的产生,但Malkiel S等[76]认为遗传因素可能会导致这两种途径在个体患者中表现出不同的优势。目前研究发现大约有100个风险位点与SLE 相关,并且这些位点内的基因已广泛地分为涉及DNA 降解和凋亡细胞碎片清除、先天免疫(包括TLR 和IFN信号传导)和获得性免疫等方面[77],大多数变异体位于非编码区域,这些区域可能通过改变表达水平,从而确定细胞谱系和阶段特异性表达方式的反应程度。现在已经发现的几种风险基因(包括LYN,BLK,BANK1,PTPN22,TNFAIP3,TNIP1,CSK 和FCGR2B)可以改变B 细胞选择、活化、分化和(或)存活[78,79],虽然这些风险基因改变了B细胞信号,但是尚未发现它们对浆细胞分化的影响。此外,这些风险基因的功能尚未确定,这就需要进一步的了解每条疾病相关信号通路以及具有遗传风险的等位基因是如何优先靶向这些途径中的一条,这将成为今后研究工作的重点。

提高对浆细胞生物学和促进浆细胞存活机制的了解将有助于进一步识别候选靶点。Hiepe F等[36]正在研发一种方法,以自身抗原特异性的方式耗尽致病性浆细胞,同时保留保护性免疫的完整性,并且考虑了靶向前体B细胞以防止自身反应性浆细胞记忆的补充。这种自身反应性浆细胞记忆的有效缺失可能是治疗各种自身免疫性疾病(包括自身抗体介导的肾脏疾病)的关键。

2.2 补体

补体系统在人体免疫过程中也起着重要作用。例如,当复合受体(complex receptor,CR)2与其C3活化片段衍生配体C3d结合时,它可以协同扩增B细胞上CD19的BCR 信号。Kulik L等人[80]研制出了一种高特异性的小鼠抗小鼠C3d单克隆抗体,其可以阻止与CR2的相互作用。在SLE的MRL/LPR 模型中,仅阻断关键的C3d-CR2配体-受体结合步骤就能显著改善自身免疫性损伤和肾脏疾病[81]。此外,NF-κB诱导激酶(NIK)介导肿瘤坏死因子家族成员(如BAFF、TWEEK、CD40和OX40)下游的非规范NF-κB 信号传导,这些都与SLE的发病机制有关。Brightbill HD 等人[81]也发现了抑制NIK 可以改善预后生存,减轻肾脏病理,降低蛋白尿评分。

2.3 T细胞靶标

T 细胞可以调节自身免疫反应,并且能够改变自身免疫功能,这与SLE 的多种表现和治疗反应密切相关。其中Th细胞是辅助B细胞分化及活化的T 细胞群体,且是一个异质性较大的T 细胞群体,因此将其作为靶标将有助于SLE的个体特异性治疗。近年来,人们将研究方向转向Th细胞,其中研究最多的主要有Treg、Th1、Th2、Th17和Tfh。

2.3.1 Treg。Treg细胞是一类具有免疫抑制作用Th细胞,可通过抑制自身反应性淋巴细胞维持自身免疫耐受。在体外和体内,Treg细胞均可以通过促进B细胞失活来抑制狼疮小鼠B细胞中自身抗体的产生。目前研究发现,SLE患者的Treg缺乏与IL-2缺乏相关,许多研究者尝试通过IL-2治疗来恢复Treg活性[82]。可以证明这一观点的是研究人员在实验中发现,随着病情的发展,狼疮小鼠体内的Treg数量逐渐减少,而且,在这些小鼠中观察到的Treg数量的逐渐减少可以通过低剂量rIL-2预防,这也可以改善疾病预后[83]。此外,研究发现,活动性SLE 患者与健康对照组及稳定期SLE 患者相比,外周循环中Treg细胞在CD4＋T细胞中的比例显著减少,减少的数量与SLE严重程度相关[84]。Rose A 等[85]通过实验发现,肾内Treg细胞表现出与肾内常规CD4＋T 细胞(T con)进行性亢进并行的IL-2缺乏的表型体征,经过IL-2短期治疗的LN 小鼠肾内的Treg数量增加,而经过IL-2长期治疗后可降低肾内T con的活性和增殖,并伴有LN 的临床和组织学的改善。因此,这为找寻SLE治疗的新靶点提供了另一种思路。且有人提出,SLE 的缺陷抑制可能是由于Treg对SLE环境中Fas介导的细胞凋亡的高敏感性所致[86],或是由于降低了效应细胞对Treg抑制的敏感性所致[87]。还有研究表明,SLE抗原呈递细胞产生IFN-α可能是改变Treg功能的原因[88]。在许多研究中均已发现Treg细胞的数量减少可能有助于SLE发病[86,89-91]。Scalapino KJ等[92]给狼疮鼠模型补充Treg细胞后发现其可以延缓疾病的发生、发展,降低病死率,这进一步证明了Treg缺陷或缺乏可引起SLE发病。

2.3.2 Th1和Th2。Th1细胞主要分泌IL-2和INF-γ等细胞因子,介导细胞免疫和迟发性超敏反应;而Th2细胞主要分泌的IL-4、IL-5和IL-6主要作用于B细胞,刺激B细胞活化及分泌免疫球蛋白来介导体液免疫。目前,Th1/Th2平衡与SLE发病之间的关联仍存在争议。早期研究已证明,在人和狼疮鼠模型中,Th1细胞的功能增强,分泌IFN-γ水平均增高,其可促进疾病发展及组织损伤,而Th2 细胞功能反而减弱[93]。Amel-kashipaz MR 等[94]发现SLE患者外周血中Th2细胞比率显著高于正常人,他们认为SLE 发病与Th2优势有关。Park SH 等[95]则发现SLE患者血清Th1、Th2型细胞因子水平均升高,并推测Th1可能主要参与诱导SLE发病,而Th2在炎症过程中发挥作用。IL-2是Tfh分化的重要负性调节因子,通过诱导STAT5依赖性Blimp1(一种Bcl-6阻遏蛋白)的表达[96-98]从而降低Tfh分化。此外,Th1细胞产生的大量的IL-2可诱导T-bet,也可以抑制Bcl-6的表达和Tfh的分化[99]。除此之外,有研究证实uhrf1下调可通过增加Bcl-6的表达促进Tfh细胞的分化[100]。因此,对患者体内的Bcl-6进行干预将成为SLE 的一种新的治疗策略。

2.3.3 Th17。Th17细胞主要通过分泌IL-17、IL-21 和IL-22等细胞因子参与自身免疫性疾病和超敏反应等的发生。Th17细胞和细胞因子IL-17与SLE疾病有关,特别是LN[8,101]。Ma KY 等人[102]证实了IL-17在狼疮发病机制中通过p38介导的BCL-XL转录稳定来提高浆细胞存活率以产生自身抗体的新功能。Reiner SL等[103,104]均认为Th17和Th1之间的平衡对维持正常免疫功能至关重要,这种不平衡将导致自身免疫性疾病的发生发展。关于IL-21R 和IL-21基因多态性的进展引起了人们的广泛关注,且有数据表明它们可能具有导致SLE的风险[105-107]。有研究发现,狼疮易感小鼠激活的CD4＋T 细胞分泌的IL-21是对照组小鼠的10倍[108],IL-21R 的缺乏将导致Tfh细胞数量的减少[109]。并且,在小鼠狼疮模型的研究中,IL-21及其mRNA 的血清水平显著升高,这表明IL-21的过度表达与疾病的发展有关[110]。还有研究表明IL-15和IL-21在体外可显著增加IFN-γ的产生,促进幼稚和记忆性CD8＋T 细胞的产生,IL-21增强了CD8＋效应T 细胞的增殖、IFN-γ的分泌和同种异体混合淋巴细胞反应的细胞毒性[111]。上述实验结果为IL-21成为SLE治疗靶点提供了理论基础和实践依据。此外,有研究发现抑制IL-23/IL-23受体信号可改善狼疮易感小鼠的疾病[112]。Lee SY 等人[113]发现,抑制IL-7可以通过抑制B 细胞向GCs的分化来改善SLE。对于IL-7的抑制从而产生的治疗效果,同样为SLE新型治疗提供了另一方向。

了解结合自身抗原后的SLE相关T 细胞发生的分子事件是解决其异常功能的关键。通过纠正异常信号分子来纠正相应的T 细胞功能,从而限制导致临床表现的后续病理的产生及进展[9],这是对于避免SLE免疫细胞异常激活后引起并发症方面取得的重大突破。此外,Th17细胞中P2X7R 表达的增加与SLE 患者的疾病活动和某些炎症介质呈正相关,这可能有助于SLE的新治疗策略的研究[114]。

2.3.4 Tfh。Tfh细胞主要表达CXCR5、PD-1和ICOS,被认为是辅助B 淋巴细胞增殖和产生抗体的主要Th细胞群,Tfh主要存在于次级淋巴器官的GC,而人外周血中鉴定出CD4＋CXCR5＋T 细胞被称为循环Tfh。目前认为,循环Tfh可能为GC Tfh的静息状态或前体[115]。研究表明,SLE 患者外周血中Tfh的数量异常增多,提示循环Tfh可能参与了SLE的发病[116]。Xu H 等[43]发现SLE患者循环Tfh数量与自身抗体产量相关,而通过抗CD40L可以降低自身抗体的产生。CD40/CD40L 通路在Tfh和B细胞活化的初始阶段起着关键作用[117-119],部分实验证明CD40在SLE患者的T 细胞(也包括B细胞和单核细胞)上呈异常高水平的表达[120,121]。此外,高表达CD40L m RNA 的女性SLE患者体内的CD4＋T 细胞能够促进自体B细胞的刺激和自身抗体的产生[122]。这些研究提示,循环Tfh在SLE 致病中起到了重要作用。最近的研究表明以CD40为靶点的KPL-404抗体在抑制B细胞反应方面具有治疗潜力[119]。CD40作为治疗SLE 的靶点具有极大潜力。

另外,一些研究人员认为IL-12/IL-23信号可能干扰Th细胞分化,并直接抑制促炎细胞因子的分泌。Gao Y 等人[123]通过小鼠实验证实了上述观点,并发现抗IL12/23 P40抗体对LN 有治疗作用,并声称其治疗效果是通过抑制小鼠Tfh细胞介导。迄今为止,尚不清楚该信号通路是否能在不影响Tfh细胞保护功能的情况下选择性限制SLE的致病性反应。而Faliti CE等人[124]观察到P2X7活性的恢复可以选择性地限制SLE患者致病性自身抗体的进行性扩增,从而加重疾病。除此之外,根据Sheng YJ等人[125]发现,Bach2的过表达可以通过抑制IRF4的表达来抑制Th9细胞分化。上述两项研究为亦探寻SLE 致病反应信号通路提供了思路。

研究发现,T 细胞数百个基因的转录在SLE 患者体内发生改变,这其中包含有线粒体、核苷酸代谢和DNA 复制相关通路等因素的影响,但是其中个别基因减少了m RNA 的转录,这与信号转导、剪接和转录活性有关,同时也与dsDNA 抗体存在、低水平的补体和肾炎的严重情况有关[126]。这就证明了SLE 患者疾病相关性克隆的改变,可以致使疾病的进展及复发。研究者们还发现SLE 患者体内的T 细胞表现出较低TCR 活化阈值、脂质筏聚集、活化后钙通量增加、炎性细胞因子过度生成以及基因表达的改变等一系列变化[9]。关于T 细胞亚群参与SLE发病机制的证据越来越多,上文对SLE 相关性的关键细胞及细胞因子的异常表达和功能进行了概述,并强调了它们作为治疗靶点的潜力。

2.4 其他潜在治疗靶点

虽然靶向T、B淋巴细胞等新的生物制剂为自身免疫性疾病的防治带来了新的曙光,但经过临床验证的特异性靶标疗法依然显著缺乏[127]。目前针对自身免疫性疾病中的自身抗体又提出一新的观点,即采用特异性封闭分子精准靶向自身抗原和自身抗体,这不仅能防治自身免疫性疾病,而且还能够避免影响机体正常的免疫应答,有望为自身免疫性疾病的防治提供新的策略。该方法是采用封闭分子竞争性的结合自身抗原或抗体,阻断其形成致病性免疫复合物,进而避免后续的炎症反应和器官组织损伤。Gaynor B等[128]研制的一种小分子肽类似物可作为靶向封闭分子中的抗原竞争性结合抗DNA 抗体,阻止其与DNA 结合,并可阻止DNA 激活TLR9。既往的SLE防治,主要是针对自身抗体的产生及其致病环节,极少有针对自身抗原环节的防治策略。靶向封闭暴露的自身抗原,阻断其被免疫系统识别可能药物治疗SLE 的另一突破性进展。有望成为靶向封闭分子的抗体有IgG4、Ig M,其中IgG4在SLE 患者体内主要起负性调控的作用,可从源头封闭自身抗原阻断自身抗原的暴露。而Ig M 抗体可以和SLE相关的双链DNA 结合以阻断dsDNA 与IgG形成致病性免疫复合物,降低LN 的发生率。这两者均可抑制致病性免疫复合物的形成,进而阻断其介导的补体活化和炎症反应。采用特异性封闭分子精准靶向自身抗原和自身抗体可针对性地缓解自身免疫性炎症,同时不影响机体正常的免疫应答,为自身免疫性疾病的防治提供新的策略,也将引领该领域新药研发的潮流。

除此之外,一些研究表明,MAP4K3(GLK)的过度表达诱导RORγt-AhR 复合物特异性地控制T 细胞中白细胞介素-17A(IL-17A)的产生,从而导致自身免疫反应。2020年,Sandling KJ等人[129]通过以基因为中心的DNA 测序发现了SLE患者中与白细胞介素-17(IL-17)相关的两条途径。Chuang HC 等人[130]发现DUSP基因家族也参与人类自身免疫性疾病(dusp2、dusp7、dusp10 和dusp12)或T 细胞激活(DUSP1、dusp5和dusp14)。因此,上述细胞因子及基因也可以被视为治疗SLE的潜在靶点。在最近的研究中,研究人员提出,SLE患者的B220＋细胞中Hspa13m RNA 增加,而Hspa13 c KO 导致小鼠自身抗体和蛋白尿减少[131]。这一研究表明热休克蛋白也可能成为治疗SLE 的一个突破口。在最新的研究中,脆弱类杆菌可通过Est-1途径促进B细胞中CD1d的表达,同时通过SHP-2途径抑制CD86的表达,从而修复MRL/Lpr小鼠中B细胞的免疫反应[132]。这一发现提示可否从微生物治疗方面着手找寻治疗自身免疫性疾病的新方案。

当自身抗原暴露于免疫系统时,表达CD138且具有中央记忆表型的T 细胞(Tcm)可通过快速激活自身反应性B细胞来促进SLE 的疾病进展[133]。而来自Ikaros锌指家族(IKZF)的IKZF1(Ikaros)和IKZF3(Aiolos)可调节TLR7下游的B细胞活化和分化,因此可作为SLE 治疗的潜在靶点[134]。Song S和他的团队已经开发出一种与非活性IRF5单体结合的抑制剂,这种抑制剂可以逆转SLE 免疫细胞中IRF5的基本活性,证实IRF5是治疗自身免疫性和炎症性疾病的一个特别有价值的双重功能治疗靶点[135]。Lu X 等人[136]今年构建了一个大规模平行报告分析(MPRA)文库,该文库强调了SLE 等位基因的共同和独特转录调控机制。这为探索SLE和其他自身免疫性疾病的潜在转录调控机制提供了一种新的方法。

3 免疫组库分析在寻找靶点中的应用

近年来,来自国内外的多个实验室正在迅猛地开展免疫组库的基础及应用研究,其应用已涉及疫苗和医药的研发、生物标志物的发现、微小残留病检测以及移植后监测等领域。而SLE 作为一种经典的自身免疫疾病,却鲜有免疫组库相关文献报道及应用转化。2015年,Zhou L[137]等首次报道了不同年龄阶段的MRL/lpr狼疮模型小鼠胸腺和脾脏TCRβCDR3受体库的组成和特征,为研究SLE 的疾病进展提供了一个新思路。随后不久,Sui W 等[138]分析了SLE患者外周血TCRβCDR3库的组成和特征,并筛选出了SLE 患者的3条公共CDR3氨基酸序列。这些研究主要是分析了SLE 模型小鼠或患者的TCRβCDR3 库组成和特征,尚未关注到SLE发病和靶标筛选。根据Bradley SJ等[126]的研究发现,通过高通量测序分析了m RNA,确定了与T 细胞功能障碍相关的新基因,并确认了干扰素相关基因(ISG)的诱导,发现T 细胞功能障碍的分子基础,认定T 细胞表达改变的程度与疾病的严重程度相关。

在近期的实验中,我们课题组同时分析了两例LN 患者在大剂量糖皮质激素治疗后外周血TCRβCDR3库和BCR-H CDR3库,结果显示T 细胞受体库多样性显著低于B细胞库,且独特性TCR CDR3数量较少,最高频CDR3克隆数达到2万以上[139]。Dharma R 等[140]在实验中发现,SLE 患者外周血中T 细胞库多样性较健康人减少了一倍,而T 细胞储备的多样性并没有发生变化。所以根据以上的研究,目前我们课题组正在采用高通量测序技术筛选出SLE患者Th1,Th2,Th17、Treg及Tfh的TCRβCDR3组库的特征,从而较为精准地确定T 细胞的精准靶向治疗的T 细胞克隆。这些通过高通量测序技术来筛选鉴定致病性免疫细胞为今后研究SLE的精准靶标提供了基础。

高通量测序技术和单细胞基因组学(SCS)(图3)的应用,使人类在免疫细胞学方面的研究发生了革命性的变化。通过高通量测序技术,可以从不同的个体中找寻到公共的BCR/TCR 序列,但是对于分析各个B/T 细胞亚群及其与传统B/T 细胞的关系,甚至是了解各细胞亚群在不同疾病中发挥的作用这些层面,高通量测序就明显失去了它的优势。另一种技术,SCS 就补充了这些方面的缺失,例如单细胞RNA-seq(sc RNA-seq)的最新进展就可以将复杂的组织和宿主间隔分解成若干细胞类型,以此来研究它们与健康和疾病的相关性[141]。

图3 SLE的传统治疗方法及单细胞测序技术的流程

Bossel Ben-Moshe N[141]等应用高通量单细胞测序建立了一个在表型、基因序列和功能水平上对小鼠TCR 谱系进行多角度描述的平台,其中所有可用的细胞都可以进行分类和分析(例如自淋巴结的滤泡性Tfh细胞),这为研究参与SLE致病的特异性TCR 的提供了一种新的方法学。Martini E 等[142]应用单细胞测序对压力超负荷心力衰竭小鼠进行研究,发现部分关键亚群特异性分子的上调,这可能能够解释抗PD-1癌症免疫治疗期间的心脏毒性等临床表现的成因,以及成为诊断或治疗心力衰竭的有用靶点。下一步的研究是否也可以建立相应的动物模型,应用单细胞测序技术对模型进行全方位的研究,以进一步明确相应的治疗靶点。

单细胞测序技术方法的最新进展能够测量形成肿瘤微环境的混合细胞类型和特定细胞类型状态的比例[143]。是否可以大胆猜测,在SLE患者体内,也存在着这样一种环境,其有利于特异性细胞发挥致病作用,推进SLE的进展。

最近的研究结果证明了癌症单细胞突变分析的前景,它将提供有关肿瘤克隆异质性的信息,而不仅仅是整体分析所提供的信息,这是迈向精确医学的重要一步[144]。最近的SCS分析成果发现了胶质母细胞瘤CSCs中差异表达的基因亚集的基因特征与肿瘤分级相关并可预估患者的生存[145],揭示了CCR8和LAYN(作为负调控因子)是肝癌相关的Treg标记基因以及它在CD8＋T 细胞(与不良预后相关)和Tregs中的诱导作用[146],并且可以为乳腺癌、骨髓增殖性肿瘤、肾癌、膀胱癌、结肠癌和急性髓系白血病的克隆结构、系统发生树和突变获取的动态提供新的见解[144]。目前已有部分研究表明,SLE 患者中Treg细胞不仅在数量上减少,而且其免疫抑制功能也降低[89],上述研究为进一步找寻SLE 相关Treg标记基因、数量减少以及免疫抑制功能降低的原因,分析SLE的克隆与亚克隆,甚至找寻到出SLE表现出高度异质性的原因。

Nehar-Belaid D 等人[147]发现,新发现的细胞亚群在儿童SLE疾病活动性高的患者中扩增,在成人SLE患者中复制,这个细胞亚群可能成为治疗的新靶点细胞。我们可以进一步通过单细胞测序技术对其进行分析,以便在在未来SLE的治疗中对其进行干预以达到治疗目的。

尽管scRNA-seq分析可以得到丰富的细胞-细胞通信基因信息,但其中缺乏空间信息,换言之,这限制了其在具有空间结构的组织中研究细胞-细胞通信的应用[148]。此时,空间转录组分析就很好的弥补了这一缺陷,其最新成果高分辨率的空间转录组学,将帮助实现整合单细胞转录组学和空间数据的阶跃变化,以提供对SLE病理的更深层次的理解。

目前单细胞表观遗传学、基因组学以及转录组学并未在SLE 的研究中进行大范围的应用,但其在基础实验、肿瘤学等方面的重大突破,为后续SLE的研究提供了新思路。对于个体差异的进一步了解,有助于人们对于疾病的病因产生新的见解以及帮助找寻新的治疗靶点,这将有助于新的个体化治疗方案的开展,尤其是对于SLE这类致病机制尚不明确、临床表型复杂、疗效不理想、副作用大的疾病。同时,建立在此基础上的各种技术的相互结合(如基因组学与转录组学、表观基因组学与转录组学、转录组学与靶向蛋白质组学),通过研究分析多个基因组层,进而捕捉到关于每个细胞的更加完整的信息集,为更好地反映负责细胞功能的复杂的相互作用网络提供了良好的技术基础,即单细胞多重组学可能更为高效[149]。

4 总结和展望

近年来,随着对SLE 发病机制的深入研究,靶向治疗药物作为治疗SLE的新型药物相较于传统疗法表现出更好的临床前景。在前人的基础上进行的各项关于SLE靶向治疗的研究,大多是针对B细胞、浆细胞、T 细胞、干扰素以及部分细胞因子。但是在对于B细胞或B细胞受体的SLE 致病相关基因的研究、浆细胞的存活机制、各型T 细胞及其细胞因子在SLE 的致病和进展中起到作用、干扰素抑制剂的改良以及特异性封闭分子的找寻等方面的研究许多缺陷。这就需要在今后的研究中,找寻治疗SLE 的特异性靶点,只有这样才能从根本上解决上述不足,找到根治SLE的方法。这不仅仅是治疗SLE 这一种疾病的进展,更可能成为攻克自身免疫性疾病的预防及治疗的一大突破口。针对以上,目前最需要突破的SLE靶向治疗的难题就是尚未找到有效的治疗靶标、无法确定常见的致病途径以及找寻到异常细胞活性与疾病活动相关的生物标志物。这就需要加深对于疾病发展进程中各种免疫细胞所发挥的作用,特异性细胞所依赖的微环境,各种细胞间的相互沟通情况,以及其中所特有的基因和细胞通路的了解。

新兴的下一代单细胞基因组方法能够同时记录和整合来自同一细胞的互补类型的细胞和分子信息[150]。目前单细胞基因组学已经影响到癌症研究的许多领域,在肿瘤内异质性、癌前病变的发展、肿瘤微环境、转移和治疗耐药性等多个方面都有卓著成果[151]。因此,空间SCS和多组学方法在内的新兴技术将在未来几年进一步扩大SCS方法的能力,为研究SLE的发病机制及致病靶点提供强有力的技术保障。

因此,随着下一代测序技术的发展,有望在高通量测序、单细胞测序等技术的支持下进行转录组、靶向蛋白质组、基因组、表观基因组、空间组等多组学的分析,进而对当前的靶向治疗进行改良,找寻更加精准的治疗靶点,在规避SLE 并发症的发生、降低SLE 的复发等方面取得突破性进展,也为新型药物的研发提供基础。在未来的临床治疗中,临床医生可以通过抽取SLE患者外周血或是采集局部病理组织对患者的基因进行测序及多组学的分析,针对患者自身基因的特点选择相应的靶向药物,制定个体化的治疗方案。精准医学已经成为疾病防治的共识,这些方法为自身免疫性疾病的防治提供新的策略,这也将引领该领域新药研发的潮流。