响应面法优化壳聚糖固定果胶酸裂解酶的研究

郁桂聪郑豪蕾王晓倩何致民高 娟

(济南大学生物科学与技术学院,山东 济南 250022)

0 引言

果胶是一类结构不均一的多糖,广泛存在于高等植物细胞壁的中间层。果胶主要由半乳糖醛酸(Gal A)通过α-1,4-糖苷键连接而成[1],包括聚半乳糖醛酸(HG)、聚鼠李半乳糖醛酸-I(RG-I)和聚鼠李半乳糖醛酸-II(RG-II)三种结构域单元[2,3]。果胶在食品、医药和精细化学等工业中具有广泛应用[4,5]。近年来的研究表明,果胶的降解产物具有良好的理化性质,作为食品添加剂,药物和化妆品材料具有广阔的应用前景[6,7]。

果胶的降解需要一系列果胶酶的协同作用。根据催化机制不同,果胶酶可分为三类:果胶解聚酶、果胶酯酶和果胶裂解酶[8,9]。其中,果胶酸裂解酶(Pectate lyase,PL,EC 4.2.2.2)断裂果胶HG 结构域中的α-1,4-糖苷键,从C-5位消去一个H 原子,在非还原端产生含有不饱和半乳糖醛酸残基的寡聚糖[10]。不同来源的果胶酸裂解酶对酸碱耐受性不同。由于果胶在碱性溶液中显示出更好的溶解性,因此碱性果胶酸裂解酶展现出更好的应用前景[11,12]。

果胶酸裂解酶被广泛应用于工业生产,如果蔬汁的萃取与纯化、苎麻纤维脱胶、果胶废水的处理等领域[13,14]。迄今为止,果胶酸裂解酶已经从各种微生物中分离出来。芽孢杆菌属细菌是微生物果胶裂解酶的主要来源之一[15,16]。本实验室的前期研究表明,多粘类芽孢杆菌的基因组中含有4个果胶酸裂解酶编码基因。对多粘类芽孢杆菌的果胶酸裂解酶Pp Pel10a的研究表明:该酶能够有效降解柑橘果胶,产物主要为不饱和的单半乳糖醛酸和低聚半乳糖醛酸。Pp Pel10a单独处理或Pp Pel10a-氢氧化钠联合处理苎麻纤维,苎麻纤维失重明显[17]。因此,该酶在果汁澄清和植物纤维加工中有潜在的应用前景。但是,PpPel10a的酶活和稳定性易受外界因素如碱性p H 和高温的影响,不利于其在工业生产中的应用。

固定化可以提高酶的使用效率和稳定性,并能降低酶的应用成本[18],为提高果胶酸裂解酶的稳定性提供了可能的解决途径[19]。戊二醛交联法是一种比较常用的酶固定化方法。交联剂的选择及交联条件对固定化酶的回收率和稳定性影响较大[20,21]。因此,在本研究中,利用单因素试验与响应面试验对壳聚糖交联固定Pp Pel10a的条件展开优化,并利用固定化Pp Pel10a进行苎麻纤维脱胶实验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组果胶酸裂解酶(Pp Pel10a):本实验室从多粘类芽孢杆菌中克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达[17];苎麻韧皮购自淘宝;多聚半乳糖醛酸(PGA)购买自上海源叶生物;50%戊二醛:天津市大茂化学试剂厂;其它试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白含量测定。以牛血清白蛋白(25～500μg/m L)为标准品,利用BCA 法绘制蛋白质含量标准曲线。根据标准曲线y＝0.8149x＋0.2247(R2＝0.9954,x轴为BSA 的浓度,mg/m L;y轴为A562)计算游离酶和固定化酶的蛋白质含量。

1.3.2 固定化PpPel10a的制备。将3 g壳聚糖溶于100 m L的2%乙酸溶液中制备成3%的壳聚糖溶液,用1 m L注射器吸取该溶液滴入乙醇:NaOH 溶液(1:4,v:v)中,4 ℃条件下硬化4 h。然后用去离子水冲洗壳聚糖小球,直至呈p H 中性,抽滤干燥。置入10 m L 3%戊二醛中,25℃振荡交联过夜。称取0.1 g壳聚糖小球载体,加入0.6 mg纯化的重组Pp Pel10a,30℃振荡吸附3 h,然后4℃静置14 h,去离子水洗涤,抽滤干燥后即得固定化酶,4 ℃储存用于后续实验。

1.3.3 果胶酸裂解酶活性测定。将0.7μg纯化酶或0.1 g固定化酶小球加入到2 m L 含有0.2%PGA 的Gly-NaOH 缓冲液中(50 mmol/L,p H 9.0),50 ℃反应15 min后,测定235 nm 处的吸光度。1 个酶活单位(U)定义为在上述条件下,每分钟使235 nm 波长处吸光度增加0.01所需的酶量[22]。固定化酶的酶活回收率＝(酶总活力-游离酶活力)/酶总活力×100%。

1.3.4 固定化条件优化。

(1)单因素试验。通过控制变量确定各因素对固定化效果的影响。变量设置条件:壳聚糖浓度分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%;戊二醛浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%;游离酶添加量:每0.1 g壳聚糖小球分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg纯化的重组Pp Pel10a;吸附时间:1、2、3、4、5、6 h;吸附温度:10、15、20、25、30、35、40 ℃。固定化方法如1.2.2所示。

(2)Plackett-Burman实验。在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验确定影响固定化效率的主要因素。利用Design-Expert 8.0软件设计N＝12的5因素2水平的Plackett-Burman试验[23],各因素的编码水平见表1。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平编码表

(3)最陡爬坡试验设计。根据Plackett-Burman试验得出三个影响酶活的显著因素,设计这三个因素的最陡爬坡路径,爬坡方向根据实验数值变化的梯度方向确定[24]。

2.广泛调查测评对象。一是调查企业生产经营与科技创新计划，分析出企业急需解决的问题，把握培训需求；二是从企业各部门了解和搜集生产、安全、成本等有关数据及情况，从中发现哪些需要人才开发的支持；三是对企业和职工进行调查，从中确定需要哪种培训；四是对全体参加培训的职工，了解他们对培训的内容、培训形式、培训技巧等有哪些基本的要求，使培训的需求调查得到可靠的结论。

(4)响应面分析优化。根据Box-Behnken试验与最陡爬坡试验结果,运用软件Design-Expert 8.0设计Box-Behnken实验[25],响应面水平见表2。使用MINITAB 16.0软件对试验数据进行处理分析[26]。

表2 响应面各因素及水平

(5)最优条件验证试验。按照响应面法试验数据得到最优的Pp Pel10a固定条件进行三次重复验证,按照1.2.3的方法测定固定化Pp Pel10a的酶活,取平均值与预测值比较。

1.3.5 固定化酶和游离酶的酶学性质比较。(1)最适p H 测定。将游离酶或固定化酶在p H 2.0～11.0的缓冲液中,加入PGA 底物后,50 ℃反应,按照1.2.3的方法分别测定游离酶和固定化酶的酶活。所用缓冲液为:Na AC缓冲液(50 mmol/L,p H 2.0～6.0),磷酸钠缓冲液(50 mmol/L,p H 6.0～8.0),Gly-NaOH 缓冲液(50 mmol/L,p H 8.0～11.0)。(2)p H 稳定性测定。将游离酶和固定化酶分别置于p H 2.0～11.0的缓冲液中,室温放置20 h,按照1.2.3的方法分别测定游离酶和固定化酶的酶活。所用缓冲液如1.2.5.1所示。(3)最适温度测定。将游离酶和固定化酶置于20～80 ℃,按照1.2.3的方法分别测定游离酶和固定化酶的酶活。以最高的酶活力定义为100%。(4)温度稳定性测定。将游离酶和固定化酶分别置于60、70 ℃水浴锅中保温60 min,在此期间间隔取样,按照1.2.3的方法分别测定游离酶和固定化酶的酶活。未保温测定的酶活记为100%。(5)操作稳定性。将固定化酶按照1.2.3的方法连续操作10次,测定相对酶活。以第一次的酶活定义为100%。

1.4 固定化Pp Pel10a处理苎麻纤维

称取2.0 g苎麻纤维,水煮10 min,分别用以下方法处理。阴性对照:50 mmol/L甘氨酸-Na OH 缓冲液(p H 9.0);酶法:固定化Pp Pel10a微球0.5 g。各实验组在50℃、100 r/min条件下振荡反应4 h。处理后的样品用去离子水清洗,干燥后失重,记录损失重量,并用SEM 观察苎麻纤维的表面。苎麻脱胶的失重率(%)＝苎麻损失重量/原苎麻重量∗100%[27,28]。

1.5 数据处理

每组实验进行三次平行实验,实验结果以平均值±标准差表示,并用SPSS Statistics 25.0 软件进行统计学分析[28]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 壳聚糖浓度对固定化Pp Pel10a效果的影响。壳聚糖的浓度对固定化酶的酶活回收率至关重要。如图1所示,在2%～3%范围内,随着壳聚糖浓度增加,固定化PpPel10a的酶活逐步升高,在3%浓度时酶活最高。随着壳聚糖浓度继续升高,Pp Pel10a酶活大幅下降。推测是由于壳聚糖浓度低于3%时,壳聚糖小球呈椭圆形,球表膜机械强度差,易形变。而壳聚糖浓度大于3%时,壳聚糖小球出现拖尾现象,刚性过强,易碎。在壳聚糖浓度为3%时,壳聚糖小球呈规则圆球形,机械强度良好,不易形变。因此,壳聚糖的浓度影响固定化小球的形状和机械强度从而对固定化酶的酶活回收率产生影响。

图1 壳聚糖浓度对固定化酶活性的影响

2.1.2 戊二醛浓度对固定化Pp Pel10a效果的影响。戊二醛作为一种双官能团交联剂,对蛋白质的交联效果较好。戊二醛浓度对固定化酶活性的影响见图2。当戊二醛浓度小于4%时,固定化效果随着戊二醛浓度增加而提高,高于4%浓度的戊二醛使固定化效果开始下降。原因可能是高浓度戊二醛导致Pp Pel10a变性失活,另一种原因可能是戊二醛浓度过高时,造成小球表面孔隙过大,导致固定化酶容易流失,造成固定化效果下降。

图2 戊二醛浓度对固定化酶活性的影响

2.1.3 游离酶添加量对固定化PpPel10a效果的影响。游离酶添加量对固定化酶活性的影响见图3。当添加量在2～8 mg·g－1范围内,固定化效果随着酶量增加而提高,固定化效果显著上升。当添加量在大于8 mg·g－1时,此时载体上的蛋白结合位点达到饱和,从而导致酶分子的相互聚集,使得固定化效果下降。

图3 酶浓度对固定化酶活性的影响

2.1.4 吸附时间对固定化Pp Pel10a效果的影响。吸附时间对固定化酶活性的影响见图4。吸附时间为5 h时固定化效果最好,从5 h开始出现下降趋势。分析原因可能是时间过长导致酶失活;另一个原因可能是已经固定化的酶向外扩散,造成酶量减少,使固定化效果降低。

图4 吸附时间对固定化酶活性的影响

2.1.5 吸附温度对固定化Pp Pel10a效果的影响。吸附温度一方面影响吸附效率,另一方面影响酶的稳定性。由图5可知,吸附温度在30 ℃时固定化Pp Pel10a的酶活最高,高于或低于30℃导致Pp Pel10a的固定化效果较差。

图5 吸附温度对固定化酶活性的影响

2.2 固定化条件的优化

2.2.1 Plackett-Burman试验设计筛选显著影响因素。根据表1实验因素的水平,使用Design-Expert 8.0设计N＝12的5因素2水平Plackett-Burman实验,验证上述五种因素对固定化效果影响是否显著。酶活结果及各因素的显著性水平分别见表3和表4。由结果可知壳聚糖浓度、戊二醛浓度以及游离酶添加量这三项因素对Pp Pel10a固定化的酶活影响较大(P＜0.05),接下来对这三个因素进行进一步优化。

表3 Plackett-Burman实验结果

表4 Plackeet-Burman试验设计的因素水平及效应分析

2.2.2 最陡爬坡试验。分析表4的PB试验结果可知,壳聚糖浓度和游离酶添加量的T 值为正值,显示这两个因素对PpPel10a的固定化具有正效应,按递增模式设计爬坡路径;戊二醛浓度的T 值为负值,表明其对Pp Pel10a的固定化具有负效应,按递减模式设计(表5)。由最陡爬坡试验结果可知,第3组为最佳因子组合,实验条件为:壳聚糖浓度(X1)3.5%,戊二醛浓度(X2)3%,游离酶添加量(X3)为8 mg·g－1。

表5 最陡爬坡试验设计及结果

2.2.3 响应面实验优化固定化条件。(1)Box-Behnken试验。根据最陡爬坡实验结果,以壳聚糖浓度、戊二醛浓度、游离酶添加量三者为自变量,PL酶活为响应值,设计N＝17的3因素3水平的Box-Behnken试验。PL酶活结果如表6所示。(2)回归方程的建立及显著性。根据Box-Behnken实验结果,经Design-Expert 8.0软件分析,确定影响固定化效果的二次回归方程:PL 酶活(U·mg－1)＝6716.18 ＋22.63X1－36.90X2＋274.63X3－195.25X1X2＋878.55X1X3－ 254.75X2X3－ 1117.62X12－ 441.42X22－ 1100.96X32。其中X1、X2和X3分别代表壳聚糖浓度、戊二醛浓度和游离酶添加量的编码水平。回归方程方差分析显著性检验结果表明:该模型的P值＜0.01(P＝0.0002),失拟项的P值＞0.05(P＝0.0877),说明该的模型失拟不显著,回归显著,能够用来对固定化酶的酶活性进行预测。一次项X3、二次项X22与交互项X2X3对固定化酶活性影响显著,二次项X12、X32与交互项X1X3对固定化酶活性影响极显著。其余均不显著。回归模型的决定系数为0.9696,说明该模型很好地反应了固定化酶的酶活与壳聚糖浓度、戊二醛浓度和游离酶添加量之间的关系,且实验误差较小,并具有良好的拟合程度。(3)响应面分析及最优条件确定。利用Design-Expert 8.0绘制响应面分析图(图6)。由响应面图可以看出:壳聚糖浓度(X1)、戊二醛浓度(X2)、游离酶添加量(X3)三个因素两两之间存在交互作用。结合各因素交互作用对固定化酶活性影响的响应面图和回归模型,当壳聚糖浓度(X1)、戊二醛浓度(X2)、游离酶添加量(X3)分别为3.5%、3%、8 mg·g－1时,预测固定化效果达到最佳,其PL酶活响应值为6733.3 U·mg－1。

表6 Box-Behnken试验设计及结果

表7 二次方模型响应面方差分析

图6 各因素交互作用影响果胶酸裂解酶固定化的响应面图

利用分析得出的最佳条件因素进行模型验证,三次平行实验得到酶活数值分别为6685.7、6742.9、6761.9 U·mg－1,与理论值6733.3 U·mg－1相比偏差极小,表明该模型可信度高。在此条件下,计算固定化Pp Pel10a的酶活回收率为87.3%。

2.3 固定化酶的酶学性质

2.3.1 最适p H 与p H 稳定性。游离状态下,PpPel10a的最适p H 为9.0,经过固定化后,PpPel10a的最适p H 迁移到10.0(图7)。碱性果胶酸裂解酶适用于果胶质的降解,具有较好的应用价值。

图7 固定化酶与游离酶的最适p H 结果

将固定化酶和游离酶放置于不同p H 缓冲液中孵育24 h后,测定其酶活力,结果如图8所示。当p H 值达到11.0时,固定化酶的残留活性仍能达到70%,而游离酶活性仅残留50%左右,说明经过固定化后,提高了游离的PpPel10a在近碱性条件下的作用效果。

图8 固定化酶与游离酶的p H 稳定性结果

2.3.2 最适温度与温度稳定性。如图9所示,固定化PpPel10a与游离状态的PpPel10a的最适反应温度均为50℃。超过50℃后,二者的相对酶活性均随温度的提高而降低,在同一温度下,固定化PpPel10a的酶活均高于游离酶。

图9 固定化酶与游离酶的最适温度测定

将固定化酶与游离酶置于60 ℃或70 ℃下孵育一段时间,检测其残余活性。如图10所示,70 ℃条件下孵育1 h,游离酶仅剩约20%的酶活,但固定化酶的酶活仍保留70%以上。此外,在同一温度下,固定化酶的相对酶活力较游离酶下降的慢。综上所述,固定化PpPel10a的热稳定性较游离酶有所提高。

图10 固定化酶与游离酶的热稳定性

2.3.3 操作稳定性。固定化酶的使用次数反映其在工业领域的应用潜力。可重复使用次数越多,该酶的应用潜力越大。如图11所示,随着使用次数的增加,固定化Pp Pel10a的酶活逐步降低。重复使用7次后,PpPel10a的酶活仍残留30%以上,这表明壳聚糖固定化后的PpPel10a重复利用率较高。

图11 固定化酶的操作稳定性测定

2.4 固定化PpPel10a处理苎麻纤维

果胶酸裂解酶可用于苎麻纤维的脱胶过程。前期研究表明,游离的Pp Pel10a在苎麻纤维脱胶过程中发挥了良好的作用。但因为苎麻纤维脱胶过程一般在碱性条件下进行,对果胶酸裂解酶的p H 稳定性要求较高,游离酶无法满足这一需求。在此,利用固定化PpPel10a进行苎麻纤维脱胶。与对照组相比,固定化Pp Pel10a处理苎麻纤维后,苎麻重量损失达20.2% ±2.3%,远高于对照组(10.1% ±0.9%)。脱胶后的苎麻纤维形态观察表明固定化酶处理比单独缓冲液处理,苎麻纤维更加柔软、洁白(图12(a、b)),SEM 扫描发现表面更加光滑(图12(c、d)),说明该固定化酶在苎麻纤维脱胶中具有潜在的应用价值。

图12 固定化PpPel10a处理苎麻纤维(a)对照组苎麻纤维形态;(b)固定化PpPel10a处理后的苎麻纤维后形态;(c)苎麻纤维SEM 扫描;(d)SEM 扫描观察固定化PpPel10a处理的苎麻纤维;SEM 放大倍数为500

3 结论

壳聚糖是一种几丁质脱乙酰产物,在食品行业已经得到了广泛应用,具有较高的安全性和蛋白吸附能力。因此本文采用壳聚糖作为固定化酶载体,并通过实验测得固定化果胶酸裂解酶Pp Pel10a的最优条件为:壳聚糖浓度3.5%、戊二醛浓度3%、酶浓度8 mg·g－1、吸附时间5 h、吸附温度30 ℃。在此优化条件下固定化酶PpPel10a的酶活回收率为87.3%。固定化PpPel10a较游离酶相比,最适p H 向碱性p H 偏移,且固定化后的Pp Pel10a的热稳定性与酸碱稳定性较游离酶相比均有所提高。固定化酶重复使用7次后残留酶活力仍有30%,说明该酶具有较好的工业生产潜力。利用固定化Pp Pel10a处理苎麻纤维,通过电子显微镜扫描发现,酶处理获得的纤维表面更加平滑且纤维分散度较高。本研究为固定化果胶酸裂解酶在纺织工业中的应用奠定了试验基础。