台湾拟金发藓二苯甲酮类化学成分及其细胞毒活性研究

刘丽娜，张学文，侯芳洁，段绪红, ，赵建成，陈玉玲

台湾拟金发藓二苯甲酮类化学成分及其细胞毒活性研究

刘丽娜1，张学文3，侯芳洁2，段绪红2, 3*，赵建成3*，陈玉玲3

1. 衡水市人民医院 药学部，河北 衡水 053000 2. 河北中医学院药学院，河北省中药炮制技术创新中心，河北 石家庄 050200 3. 河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016

对台湾拟金发藓全草的化学成分及其细胞毒活性开展研究，为其进一步开发提供科学依据。采用硅胶、Sephadex LH-20凝胶、MCI-Gel树脂柱色谱、半制备型RP-HPLC等多种色谱技术进行分离纯化，运用波谱方法对所分离的化合物进行结构鉴定，采用MTT法测试化合物对人肝癌HepG2细胞和人胰腺癌PANC-1细胞的细胞毒活性。从台湾拟金发藓植物中分离得到4个化合物，分别鉴定为2′′-(1-苯甲酰基-2-羟基-4-苯氧基)--(2′′′-羟基-乙基)-乙酰胺（1）、(2-羟基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮（2）、(2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮（3）、(2,4-二羟基-苯基)-苯基-甲酮（4）；部分化合物显示出了一定的细胞毒活性。化合物1为新化合物，命名为金发藓酮B；化合物2～4为新天然产物，首次从金发藓科植物中分离得到；化合物1对人肝癌HepG2细胞具有较强的细胞毒活性，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为38.14 μmol/L。

金发藓科；台湾拟金发藓；二苯甲酮；金发藓酮B；细胞毒活性

台湾拟金发藓为金发藓科拟金发藓属植物台湾拟金发藓(Hedw.) G. L. Sm. 的干燥全草。广泛分布于我国四川、云南、贵州等西南省区。常生长于林下潮湿土壁，植株体相对较大。金发藓科植物因植株较高大、容易被识别与采集、药用历史记载悠久而备受关注，近年来，陆续有学者对该科植物的化学成分及药理活性开展了系列研究，从中得到了一系列结构新颖的活性化合物[1-5]。课题组前期也从该植物中分离得到了部分生物活性较好的化合物[6]，为了进一步开发利用该植物资源，本实验继续对台湾拟金发藓植物进行了化学成分研究，从中分离得到了4个二苯甲酮类化合物（图1），分别鉴定为2′′-(1-苯甲酰基-2-羟基-4-苯氧基)--(2′′′-羟基-乙基)-乙酰胺[2′′-(1-benzoyl-2- hydroxy-4-phenoxy)--(2′′′-hydroxy-ethyl)-acetamide，1]、(2-羟基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮[(2-hydroxy- 4-methoxy-phenyl)-phenyl-methanone，2]、(2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮[(2,4-dimethoxy-phenyl)- phenyl-methanone，3]和(2,4-二羟基-苯基)-苯基-甲酮[(2,4-dihydroxy-phenyl)-phenyl-methanone，4]。经Scifinder检索，发现化合物1为新化合物，化合物2～4为新天然产物，首次从金发藓科植物中分离得到。初步药理结果显示，化合物1对人肝癌HepG2细胞具有较强的细胞毒活性，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为38.14 μmol/L。化合物2～4对HepG2细胞和人胰腺癌PANC-1细胞的增殖均无显著影响。

图1 化合物1～4的化学结构

1 仪器与材料

Agilent 6530B Q-TOF质谱仪（美国Agilent公司）；X-5A显微熔点测定仪（巩义市科瑞仪器有限公司）；Bruker AV-500核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；二氧化碳培养箱（上海BPN-240CRH公司）；SYNERGY多功能酶标仪（美国Bio Tek公司）；R-1020旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；柱色谱用硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工有限公司）；GF254预制硅胶板（青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；ODS柱色谱材料（YMC公司）；MCI柱色谱材料（MCI-gel CHP-20P，日本三菱公司）；安捷伦1200型半制备HPLC分析仪器（高效液相色谱仪）；制备用色谱柱：Zorbax Prep HT GF（250 mm×21.2 mm，7 μm）；色谱乙腈和色谱甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；水（自制，Milli-Q型超纯水机）；其他试剂为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；HepG2细胞、PANC-1细胞细胞株（美国ATCC）。

台湾拟金发藓样品2019年10月采于贵州梵净山国家级自然保护区，标本经河北师范大学生命科学学院赵建成教授鉴定为金发藓科拟金发藓属植物台湾拟金发藓(Hedw.) G. L. Sm.的全草。凭证标本（HBSD2019110401）保存于河北师范大学生命科学学院系统与进化实验室。

2 提取与分离

称取台湾拟金发藓晒干植株1.3 kg，粉碎成粗粉后过30目筛，并用95%乙醇浸泡提取5次（每次溶剂用量5 L，提取时间3 d），过滤后合并提取液，减压浓缩成稠浸膏（39.1 g）。将粗提物用热水分散后，依次用石油醚（30～60 ℃）、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取。各极性部位萃取液再减压浓缩，得萃取物。其中二氯甲烷萃取物（7.5 g），上MCI凝胶柱，用甲醇-水溶剂系统梯度洗脱，90%甲醇洗脱部分减压浓缩得浸膏（3.1 g），该浸膏用5 g硅胶（100～200目）湿法拌样，烘干，干法上样，过150 g硅胶（200～300目）柱色谱，采用石油醚-丙酮（10∶1、5∶1、3∶1、3∶2、1∶1）梯度洗脱，分成5个馏份Fr. 1～5。Fr. 2（850 mg）通过ODS柱（依次用30%、60%、90%甲醇洗脱）得到7个亚组分Fr. 2.1～2.7。将Fr. 2.2用适量甲醇溶解，采用反相色谱柱法，以60%乙腈-水溶液为流动相，体积流量为15 mL/min进行制备液相分离，收集17.5 min色谱峰，得化合物粗品，粗品再经 Sephadex LH-20 柱纯化后得化合物1（7.1 mg）；Fr. 2.3经制备柱色谱（甲醇-水53∶47，8 mL/min）得到Fr. 2.3.1～2.3.5，再将Fr. 2.3.3经半制备柱色谱得到化合物3（9.2 mg，R＝31.4 min，乙腈-水21∶79）。Fr. 2.5经制备柱色谱（甲醇-水40∶60，8 mL/min）得到Fr. 2.5.1～2.5.4，将Fr. 2.5.1经半制备柱色谱得到化合物2（8.8 mg，R＝17.3 min，乙腈-水32∶78）。将Fr. 2.5.3经半制备柱色谱得到化合物4（5.9 mg，R＝42.6 min，乙腈-水18∶82）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（氯仿）；HR-ESI-MS/: 316.118 2 [M＋H]+（计算值316.117 9），推测其分子式为C17H17O5N，不饱和度为10。紫外光谱在241（1.50）、284（2.35）、325（1.33）nm处显示出了吸收峰。红外光谱提示结构中含有羟基（3319 cm−1），羰基（1898 cm−1），苯环（3058、1640、1503 cm−1）等基团。1H-、13C-NMR（表1）显示化合物中存在17个碳和17个氢原子。其中低场区显示有8个芳香氢信号；H7.63 (1H, d,= 8.6 Hz, H-6), 6.47 (1H, dd,= 8.6 1.4 Hz, H-5), 6.60 (1H, d,= 1.4 Hz, H-3) 信号显示存在1个1,2,4-三取代苯环偶合系统；同时还存在1个单取代苯环结构片段H7.70 (2H, d,= 7.4 Hz, H-2′, 6′), 7.56 (2H, d,= 7.4 Hz, H-3′, 5′), 7.62 (1H, dd,= 7.4, 1.2 Hz, H-4′)；高场区氢信号显示存在1个连氧亚甲基信号H4.63 (2H, s, H-2′′)；1个连氧乙基信号H3.60 (2H, m, H-1′′′), 3.85 (2H, m, H-2′′′)。13C-NMR谱中给出了17个碳信号，结合DEPT和HSQC谱，可以推断含有1个连氧亚甲基碳信号（C66.7）、1个连氧乙基碳信号（C61.6, 41.5）、8个次甲基碳信号（C102.3, 106.2, 128.4, 128.4, 127.9, 127.9, 131.3, 135.2）和6个季碳信号（C113.9, 137.6, 162.7, 165.6, 167.6, 199.7），并对直接相连的1H- 和13C-NMR信号进行了准确归属（表1）。通过文献报道[6]比对，发现该化合物与2-(4-benzoyl-3- hydroxyphenoxy)--propylacetamide的NMR信号非常相似，主要不同之处在于少了1个甲基信号。同时在HMBC（图2）中，H-2′、H-6′与C=O (C199.7) 的相关信号以及H-3′、H-5′与C-1′ (C137.6) 的相关信号证实了B环为单取代，且C-1′与羰基相连；H-6 (H7.63) 与C-1 (C113.9)、C-4 (C165.6) 和C-7 (C199.7) 存在相关信号，H-3 (H6.61) 与C-1 (C113.9)、C-5 (C106.2) 存在相关信号，同时H4.63与C165.6 (C-4) 的相关信号表明乙氧基侧链与C-4相连，充分印证了A环为ABX偶合系统；也提示上述A、B环构成了1个二苯甲酮的结构片段；H4.63与C167.6 (C-1′′) 的相关信号表明连氧亚甲基与羰基直接相连；H-1′′′ (H3.60) 与C-2′′′ (C61.6)、H-2′′′ (H3.85) 与C-1′′′ (C41.5)的相关信号，H-1′′′与H-2′′′的COSY相关信号印证了乙基结构片段的存在；H3.61与C167.6 (C-1′′) 的远程相关信号，-NH (H7.01) 与H-1′′′的COSY相关信号提示乙基连接在酰胺基团的N原子上。至此，化合物1的结构确定为2′′-(1-苯甲酰基-2-羟基-4-苯氧基)--(2′′′-羟基-乙基)-乙酰胺，经Scifinder检索，化合物1为1个新化合物，命名为金发藓酮B。

表1 化合物1的NMR数据(500/125 MHz, CDCl3)

Table 1 NMR data (500/125 MHz, CDCl3) for compound 1

碳位δcδH 1113.9 (s) 2162.7 (s) 3102.3 (d)6.60 (1H, d, J = 1.4 Hz) 4165.6 (s) 5106.2 (d)6.47 (1H, dd, J = 8.6, 1.4 Hz) 6135.2 (d)7.63 (1H, d, J = 8.6 Hz) 2-OH 12.63 (1H, s) NH 7.01 (1H, brs) 7199.7(s) 1′137.6 (s) 2′, 6′128.4 (d)7.70 (2H, d, J =7.4 Hz) 3′, 5′127.9 (d)7.56 (2H, d, J = 7.4 Hz) 4′131.3 (d)7.62 (1H, dd, J = 7.4, 1.2 Hz) 1′′167.6 (s) 2′′ 66.7 (t)4.63 (2H, s) 1′′′ 41.5 (t)3.60 (2H, m) 2′′′ 61.6 (t)3.85 (2H, m)

图2 化合物1的主要COSY ()及HMBC () 相关

化合物2：淡黄色结晶（甲醇），mp 65～67 ℃；ESI-MS/: 229.2 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 12.61 (1H, s, 2-OH), 7.56 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 7.50 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz，H-4′), 7.47 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.41 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.45 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.33 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5), 3.79 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 200.0 (C=O), 166.3 (C-2), 166.2 (C-4), 138.2 (C-1′), 135.2 (C-6), 131.4 (C-4′), 128.8 (C-2′, 6′), 128.2 (C-3′, 5′), 113.1 (C-1), 107.3 (C-5), 101.0 (C-3), 55.6 (-OCH3)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物2为 (2-羟基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮，经Scifinder检索，为首次从天然产物中分离得到。

化合物3：淡黄色结晶（甲醇），mp 86～88 ℃；ESI-MS/: 243.3 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.69 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′,6′), 7.45 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz, H-4′), 7.35 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.33 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.48 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.43 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.62 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 195.5 (C=O), 163.3 (C-2), 159.6 (C-4), 138.8 (C-1′), 132.3 (C-6), 132.1 (C-4′), 129.6 (C-2′, 6′), 127.9 (C-3′, 5′), 121.5 (C-1), 104.5 (C-5), 98.8 (C-3), 55.6 (-OCH3), 55.5 (-OCH3)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物3为 (2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮，经Scifinder检索，为首次从天然产物中分离得到。

化合物4：白色结晶（甲醇），mp 142～143 ℃；ESI-MS/: 215.2 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.64 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz, H-4′), 7.53 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.51 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.49 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.37 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 200.3 (C=O), 166.1 (C-2), 162.9 (C-4), 138.2 (C-1′), 136.2 (C-6), 131.6 (C-4′), 128.9 (C-2′, 6′), 128.4 (C-3′, 5′), 113.6 (C-1), 107.7 (C-5), 103.7 (C-3)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物4为 (2, 4-二羟基-苯基)-苯基-甲酮，经Scifinder检索，为首次从天然产物中分离得到。

4 抗肿瘤活性测定

参考文献方法[10]，采用MTT法检测化合物1～4对HepG2细胞和PANC-1细胞的体外细胞毒活性。结果表明，化合物1可显著抑制HepG2细胞的增殖，抑制作用表现出了剂量相关性，50 μmol/L的抑制率达到62%，IC50值为38.14 μmol/L，显示出了较强的细胞毒活性。而化合物2～4对HepG2和PANC-1细胞增殖无显著影响。

5 讨论

本实验对台湾拟金发藓95%乙醇水浸提物的二氯甲烷萃取部位进行分离纯化，得到4个二苯甲酮类化合物，其中化合物1为新化合物，化合物2～4为新天然产物。体外细胞毒活性实验表明，化合物1对HepG2细胞具有较好的细胞毒活性。

前期研究发现，金发藓科金发藓属植物金发藓[11]和小金发藓属植物东亚小金发藓[12]均含有二苯甲酮类，与拟金发藓属台湾拟金发藓植物具有高度相似性，说明该科上述三个属植物的亲缘关系较近，这也与三者在植物形态上具有相似性相吻合，可以从化学分类学角度对金发藓科植物分类提供一定的参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Benzophenones from endohydric mossand their cytotoxic activities

LIU Li-na1, ZHANG Xue-wen3, HOU Fang-jie2, DUAN Xu-hong2, 3, ZHAO Jian-cheng3, CHEN Yu-ling3

1. Department of Pharmacy, Hengshui People′s Hospital, Hengshui 053000, China 2. Traditional Chinese Medicine Processing Technology Innovation Center of Hebei Province, School of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China 3. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China

To investigate the chemical constituents and cytotoxic activity of the whole plant of, and provide scientific basis for its further development.Various chromatographic techniques such as silica gel, Sephadex LH-20 gel, MCI-Gel resin column chromatography and semi-preparative RP-HPLC were used for separation and purification. Their structures were elucidated by spectroscopic data analyses. The cytotoxicity of compounds for HepG2 and PANC-1 cells line was also evaluated by using the MTT method.Four compounds were isolated and identified as 2′′-(1-benzoyl-2-hydroxy-4-phenoxy)--(2′′′-hydroxy-ethyl)-acetamide (1), (2-hydroxy-4-methoxy-phenyl)-phenyl-methanone (2), (2,4-dimethoxy-phenyl)-phenyl-methanone (3), and (2,4-dihydroxy-phenyl)-phenyl-methanone (4). Some compounds showed certain cytotoxic activity.Compound 1 is a new compound named pogonatone B; Compounds 2—4 are new natural products, and isolated from Polytrichaceae species for the first time; Compound 1 also displays the high cytotoxicity on HepG2 cell with IC50values of 38.14 μmol/L.

Polytrichaceae;(Hedw.) G.L.Sm.; benzophenones; pogonatone B; cytotoxic activity

R284.1

A

0253 - 2670(2022)03 - 0667 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.003

2021-10-12

国家自然科学基金资助项目（31070184）；河北中医学院博士科研基金资助项目（BSZ2021020）；全国中药特色技术传承人才培训项目（T20194828003）

刘丽娜（1974—），副主任中药师，研究方向为中药鉴定及制剂开发。E-mail: 18631811807@163.com

段绪红（1982—），博士，副主任中药师，研究方向为中药化学与炮制。E-mail: duanxuhong@126.com

赵建成（1956—），教授，博士生导师，研究方向为藓类植物化学与分类。E-mail: zhaojiancheng@mail.hebtu.edu.cn

[责任编辑 王文倩]