不同来源竹茹药材HPLC指纹图谱和化学计量学分析

周冰倩，高喜梅，杨 颖，王令充，张 雯，赵晓莉，狄留庆*

不同来源竹茹药材HPLC指纹图谱和化学计量学分析

周冰倩1, 2，高喜梅1, 2，杨 颖1, 2，王令充1, 2，张 雯1, 2，赵晓莉1, 2，狄留庆1, 2*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，江苏 南京 210023

建立不同来源竹茹药材HPLC指纹图谱，结合相似度、聚类、主成分分析等化学计量手段评价不同产地竹茹药材品质，为其质量控制研究提供技术方法借鉴和基础数据。通过HPLC梯度洗脱建立23个批次竹茹药材的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）对竹茹药材HPLC指纹图谱进行相似度评价，并采用SPSS24.0软件进行聚类、主成分分析。选取了13个色谱共有峰，23批样品共有峰相似度在0.713～0.991；聚类分析将23批样品分为2类；主成分和因子分析筛选出累积方差达77.83%贡献率的3个主成分，能够反映23个批次竹茹药材特征性质量差异。建立分析的HPLC指纹图谱结合化学计量学评价方法，简便可行，可为综合评价不同产地竹茹药材的质量提供参考。

竹茹药材；指纹图谱；聚类分析；化学计量学；质量评价；尿苷；腺苷；鸟苷；对羟基苯甲酸；对香豆酸

竹茹为禾本科植物青秆竹Munro大头典竹(Munro)McClurevar.P. F. Li或淡竹(Lodd.)(Mitf.)Stapf ex Rendle的茎秆的干燥中间层，味甘，性微寒，有清热涤痰、和胃降逆止呕的功效[1]，资源分布广泛，主产于四川、江西、湖北、安徽等地，临床多用于治疗痰热咳嗽、胃热呕吐、妊娠恶阻。竹茹入药始见于《金匮要略》，称“竹皮”。《药品化义》记载：“竹茹轻可去实，凉能去热，专清痰，为宁神开郁佳品”。竹茹是临床常用中药之一[2]，也是卫生部批准的“可用于保健食品的物品”。目前为止，《中国药典》2020年版[3]关于竹茹药材的质量控制标准仅有水分和浸出物项目，其化学成分及质量控制也未见深度研究报道。

指纹图谱作为一种能被国内外广为接受的中药质量评价模式，具有整体性和模糊性的特点[4-5]。HPLC指纹图谱结合化学计量学分析，为整体、综合、全面中药材质量控制提供了新的思路。为合理地评价药材质量，本实验收集全国12个省、自治区23批不同产地的竹茹药材，收集范围基本涵盖竹茹的主要产区，建立竹茹药材的HPLC指纹图谱，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）进行相似度评价，运用SPSS软件进行聚类分析和主成分分析，以期为竹茹药材指标成分的筛选及竹茹药材的鉴定和质量标准研究提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪，PDA检测器和Empower工作站（美国Waters公司）；SB25-12DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率220 W，频率45 kHz）；CPA225D型1/10万分之一电子天平（南京以马内利仪器设备有限公司）；XP6型百万分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-S8型数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）。甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），实验用水为实验室自制超纯水。HPLC用甲醇为色谱纯。

1.2 材料

对照品鸟苷（批号111977-201501）、腺苷（批号110879-201703）购自中国食品药品检定研究院，尿苷（批号B20907）、对香豆酸（批号B20335）、对羟基苯甲酸（批号B20328），购自源叶生物科技有限公司，质量分数均大于98%。实验用竹茹药材经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为禾本科植物青秆竹Munro大头典竹(Munro)var.P. F. Li或淡竹(Lodd.)(Mitf.)Stapf ex Rendle的茎秆的干燥中间层，共23批，产地、批号及采购途径见表1。

表1 竹茹药材来源

Table 1 Source of C. Bambusae In Taeniam

编号批号产地采购途径 S120190208江西南通精华制药 S220190301江西南通精华制药 S320190126四川长春市方一堂经贸有限公司 S420180901广西南京大华药房 S520190403广西毫州永刚饮片厂有限公司 S620190522广西淘宝药王谷中草药销售 S720180911浙江南通精华制药 S820180505浙江南通精华制药 S920190509浙江南通精华制药 S1020190510浙江南通精华制药 S1120190520浙江南通精华制药 S1220190525浙江毫州永刚饮片厂有限公司 S1320190410福建南通精华制药 S1420180402福建南通精华制药 S1520180610安徽淘宝桃源人家 S1620190515安徽河北金叶子药业有限公司 S1720180513安徽毫州永刚饮片厂有限公司 S1820190326湖南淘宝炳然旗舰店 S1920181201湖北南京大华药房 S20190301c63河南淘宝佐今明大药房 S21181200271广东卡莱诺中港大药房 S2220180804山东安国市芳草佳商贸有限公司 S2320190402河北淘宝聚旭堂旗舰店

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷、对香豆酸、对羟基苯甲酸对照品适量，加甲醇制成含尿苷1.01 mg/mL、鸟苷1.03 mg/mL、腺苷1.02 mg/mL、对香豆酸1.02 mg/mL、对羟基苯甲酸1.01 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

精密称定2.0 g竹茹药材粉末（过2号筛），置于150 mL具塞瓶中，加水100 mL，称定质量，超声提取45 min，取出放冷后补足失重，10 000 r/min离心20 min。取上清液，水浴蒸干，50%甲醇复溶至2 mL，摇匀，高速离心取上清液，即得。

2.3 色谱条件

Megres C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，0～5 min，2% A；5～15 min，2%～12% A；15～35 min，12%～18% A；35～45 min，18%～22% A；45～60 min，22%～35% A；60～75 min，35% A；75～85 min，35%～2% A；85～90 min，2% A；体积流量1 mL/min，进样量10 μL，检测波长260 nm，柱温30 ℃。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取S21号样品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液适量，按“2.3”项下色谱条件进行检测，连续进样6次。记录色谱图，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。以7号峰对羟基苯甲酸为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.12%，相对峰面积RSD为1.11%～2.24%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取S21号样品粉末，按“2.2”项下制备方法平行制备6份，按“2.3”项下色谱条件分别进样检测。记录色谱图，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。以7号峰对羟基苯甲酸为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.03%～0.11%，相对峰面积RSD为1.42%～5.54%，样品重复性尚可。

2.4.3 稳定性试验 取S21号样品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液适量，室温保存，按“2.3”项下色谱条件进样分析，分别在0、2、4、8、12、24 h进样。记录色谱图，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。以7号峰对羟基苯甲酸为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD为0.05%～0.39%，相对峰面积RSD为0.30%～2.90%，表明该供试液在24 h内基本稳定。

2.5 不同产地竹茹药材指纹图谱分析

2.5.1 HPLC指纹图谱的生成 取23批竹茹药材样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，得HPLC指纹图谱，见图1。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）对23批药材样品的HPLC图谱进行分析，共标定了13个共有峰，通过与对照品比对，指认出5个峰，分别为尿苷（2号峰）、腺苷（3号峰）、鸟苷（4号峰）、对羟基苯甲酸（7号峰）、对香豆酸（12号峰）。选取对羟基苯甲酸（7号峰）为参照峰，建立竹茹药材的对照指纹图谱、混合对照品、指纹图谱共有模式及叠加图见图1。

2.5.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版），以对照指纹图谱的HPLC图谱为对照，进行整体相似度评价，见表2。以S1为参照图谱，设置时间窗宽度为0.5，谱多点校正并自动匹配，按中位数法生成对照图。结果表明，23批样品的相似度在0.713～0.990，说明收集的不同产地竹茹药材整体概貌有一定差异。

2.6 竹茹药材指纹图谱聚类分析

聚类分析是一种在没有先验知识的前提下，将每个样本的特征数据按照性质上的亲疏程度进行分组，使其组内个体具有高度相似性，而组间个体具有较小相似性的一种分析手段[6]。将23批不同产地的竹茹药材标定的13个共有峰面积导入SPSS 24.0软件，以欧式平方距离为测度，Z标准化，采用组间连接法进行Q型聚类分析。在类间距为15时，23份样品被分为2类。S1、S2号样品首先聚为一类，S3～S23号样品聚为另一类，具体见图2。

2-尿苷 3-腺苷 4-鸟苷 7-对羟基苯甲酸 12-对香豆酸

2-uridine 3-adenosine 4-guanosine 7--hydroxybenzoic acid 12--coumaric acid

图1 指纹图谱共有模式(A)、混合对照品(B)及23批竹茹药材HPLC叠加图谱(C)

Fig. 1 Common patterns in fingerprints (A),mixed reference control (B) and HPLC superimposed spectrum of 23 batches of(C)

表2 不同产地竹茹药材指纹图谱相似度

Table 2 Similarity of fingerprints of C. Bambusae In Taeniam of 23 batches in different regions

批次相似度批次相似度 S10.729 S130.826 S20.738 S140.784 S30.972 S150.902 S40.767 S160.895 S50.895 S170.713 S60.890S180.982 S70.990 S190.914 S80.987 S200.982 S90.984 S210.911 S100.962 S220.927 S110.941 S230.739 S120.855

图2 竹茹指纹图谱聚类树状关系

2.7 主成分分析及因子分析

主成分分析是将多个相互关联的多变量通过线性变换，在保留原始数据大部分信息的前提下将众多变量浓缩为少数几个变量，从而发现变量间的联系的分析手段，是最常用的多指标线性降维压缩和多变量分析方法之一，能够尽可能的揭示数据结构特征，提取化学信息[7]，目前已广泛应用于中药的评价与鉴别。

采用SPSS24.0软件对23批竹茹药材的13个共有峰峰面积原始数据进行标准化处理，以主成分贡献率及特征值为依据，进行主成分因子分析。本研究通过考察提取特征值、碎石图（主成分特征值的连续陡峭部分）、累积方差贡献率来确定最佳主成分数。由图3和表3可知，前3个主成分提取特征值较大（λ＞1），连线较陡峭，对解释变量的贡献最大，提取前3个主成分较为合适。其累积方差贡献率为77.83%，即选取3个主成分涵盖了13个成分77.83%的信息量。

通过正交旋转，得到13个指标在3个主成分中的旋转成分矩阵，见表4。根据旋转成分矩阵推测，影响竹茹药材质量差异的成分不是单一成分，而是多成分协同作用的结果[8]。由表4可知，第1主成分的信息主要来自峰1、7、8、10、11、12；第2主成分的信息主要来自2、3、4、5、6、9；第3主成分的信息主要来自色谱峰13。由竹茹药材主成分分析三维图可以看出，23批竹茹药材被分为2大类，结果与聚类分析一致（图4）。

图3 公共因子碎石图

表3 主成分方差分析

Table 3 Variance analysis of principal component

峰号初始特征值方差贡献率/%累积贡献率/% 14.7736.6836.68 24.1031.5568.23 31.25 9.6077.83

表4 竹茹药材成分矩阵

Table 4 Component matrix ofC. Bambusae In Taeniam

峰号成分 123 1 0.782−0.023 0.022 2 0.282 0.827 0.165 3−0.244 0.866 0.005 4 0.182 0.562−0.487 5−0.056 0.904−0.046 6 0.146 0.716−0.082 7 0.961 0.047 0.192 8 0.890 0.017−0.010 9−0.095 0.811 0.224 10 0.964−0.162 0.062 11 0.933−0.251 0.163 12 0.657 0.404−0.437 13−0.052 0.331 0.816

3 讨论

本实验考察了不同提取溶剂（水，甲醇）、提取方法（加热回流提法，超声提取法）、提取时间（30、45、60 min）对竹茹药材提取效率的影响，发现加热回流提取法与超声提取法无显著差异，水提取效果最佳，最终确定了竹茹药材提取方法为水超声提取45 min。在指纹图谱分析方法的建深入摸索中，先后考察了不同有机相（乙腈、甲醇），水相（水、0.1%甲酸水、0.1%磷酸水）对指纹图谱的影响。结果显示，采用甲醇-0.1%甲酸水进行梯度洗脱，获得的指纹图谱基线平稳，各个主要峰基本得到分离，且分离度良好。在全波长扫描下，260 nm检测条件下处色谱峰出峰较多，分离度良好，各峰吸收均匀，故最终选择的检测波长为260 nm。龚金炎等[2]应用高效液相半制备色谱，从竹茹中分离出苜蓿素作为对照品，本研究曾在条件摸索过程中采用UFLC-Q-TOF-MS，负离子检测模式下检测出低含量的苜蓿素。

图4 竹茹药材主成分得分图

通过淘宝线上旗舰店、线下药房和药物饮片公司等途径等收集到了23批源自12个省的药材，其中，四川、湖南、湖北、河南、广东、山东、河北各1批，江西、福建各2批，广西、安徽各3批，浙江6批。在指纹图谱HPLC分析方法建立的过程中发现，样品的重复性在1.42%～5.54%。稍差的样品测量重复性推测与样品来源有关。《中国药典》2020年版规定，竹茹的药材基原为同种亚科不同族的植物：淡竹、青竿竹、大头典竹，仅从竹茹药材本身无法追溯到具体基原。另外，市售的药材来源复杂，质量良莠不齐，对重复性测定有一定影响。此外，结合化学计量学手段，较为客观地对样品进行分析。23批竹茹药材样品的相似度为0.713～0.990，说明不同产地、不同来源的药材在化学成分及含量存在一定差异。其中，同一厂家提供的同一产地不同批次之间的样品相似度有所差异，这可能由于不同采收时间、地点导致的药材质量差异。为保证药材质量的批间一致性，可建议厂家或产地加工商严格控制药材的初加工过程。聚类分析和主成分分析将23批竹茹药材分为2类，其中，江西产地的竹茹药材被分为一类，其他产地的竹茹药材被分为另一类，推测江西省的竹茹药材在主成分种类及含量上可能与其他产地的竹茹药材具有一定差异，而其他省份竹茹药材的化学成分较为相似，但目前尚无法明确识别各产地药材质量的优劣，后期将在此基础上进一步完善竹茹药材的质量评价研究。

中药化学成分复杂多样，有效成分难以一一明确，如何在化学成分不完全明确的前提下对药材进行质量控制十分有必要。指纹图谱结合聚类、主成分分析等化学计量学手段可以用于综合评价中药饮片的质量优劣，避免了以单一成分含量来评价饮片质量好坏的弊端[8]。本研究在HPLC条件下建立了竹茹药材的指纹图谱，在后续研究中，考虑可采用质谱结合核磁共振技术，进行多手段、多仪器分析，以期明确竹茹中的指标性成分并对竹茹药材质量控制进行全面评价研究。

基于《中国药典》2020年版未涉及竹茹药材的HPLC质量控制相关内容，本实验建立了具有较好重复性和专属性的HPLC指纹图谱，并结合聚类、主成分因子分析等化学计量学方法，对不同产地竹茹药材的质量进行多方面的综合评价，为从多角度多方位分析竹茹药材的质量控制提供参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality analysis offrom different origins by HPLC coupled with chemometrics

ZHOU Bing-qian1, 2, GAO Xi-mei1, 2, YANG Ying1, 2,WANG Ling-chong1, 2, ZHANG Wen1, 2, ZHAO Xiao-li1, 2,DI Liu-qing1, 2

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2.Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of Traditional ChineseMedicine, Nanjing 210023, China

To establish the fingerprints offrom different habitats by HPLC, and comprehensively analyze the quality ofby the similarity evaluation in combination with principal component, clustering, principal component analysis (PCA) and other chemo-metrics, so as to provide theoretical basis for its quality evaluation.The fingerprints of 23 batches ofwere established by HPLC gradient elution, and the similarity evaluation of the HPLC fingerprints ofmedicinal materials was carried out using the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2012A version), and SPSS24.0 software was used for clustering and PCA analysis.Thirteen chromatographic peaks were selected as the common peaks, and the similarity of the 23 batches was 0.713—0.991. Principal components and PCA analysis screened out three principal components with cumulative variance contribution rate of 77.83%, reflecting the quality characteristic differences of 23 batches ofmedicinal materials.HPLC fingerprint established in this experiment combined with the chemometric evaluation method is simple, feasible and reproducible, and can be used to comprehensively evaluate the quality offrom different producing areas.

;fingerprint;cluster analysis; chemometrics; quality evaluation; uridine; adenosine; guanosine;-hydroxybenzoic acid;-coumaric acid

R286.2

A

0253 - 2670(2022)03 - 0853 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.026

2021-08-06

江苏省研究生科研与实践创新计划项目（SJCX20_0560，SJCX20_0563）

周冰倩（1996—），女，江苏淮安，硕士研究生，研究方向为中药学。E-mail: 1776093511@qq.com

狄留庆（1964—），男，教授，研究方向为中药制剂研究与新产品研发。E-mail: diliuqing928@163.com

[责任编辑 时圣明]