金刚鹦鹉性别的快速分子生物学鉴定

朱向蕾 王瑛莹 周立晨

摘要 应用引物2550F/2718R对上海动物园内蓝黄金刚鹦鹉和红绿金刚鹦鹉的CHD基因进行PCR扩增，进行性别鉴定。经过琼脂糖凝胶电泳发现：雄性个体扩增出1条片段，大小647 bp;雌性个体扩增出2条片段，大小分别为630和411 bp。蓝黄金刚鹦鹉群体的雌雄比为10∶17，红绿金刚鹦鹉群体的雌雄比为5∶4。该方法能准确、快速、有效地进行2种金刚鹦鹉的性别鉴定，为该鸟类种群饲养繁育提供基础性别信息。

关键词 金刚鹦鹉;性别鉴定;CHD基因

中图分类号 S 865.3+5  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.025

Rapid Molecular Biology Identification of the Sex of Macaw

ZHU Xiang-lei， WANG Ying-ying， ZHOU Li-chen

（Shanghai Zoo， Shanghai 200335）

Abstract Primers 2550F/2718R were used to amplify CHD gene of Ara ararauna and Ara chloropterus in Shanghai Zoo by PCR. Agarose gel electrophoresis results showed that the male individuals amplified one band with the length of 647 bp， while the female individuals amplified two bands with the length of 630 and 411 bp respectively. The male-female ratio of A. ararauna was 10∶17. The male-female ratio of A. chloropterus was 5∶4. This method could accurately， quickly and effectively identify the sex of two species of macaw， and provide the basic sex information for the feeding and breeding of macaw population.

Key words Macaw;Sex identification;CHD gene

基金項目 上海市绿化和市容管理局科研专项（GZ180409）;上海动物园科技攻关项目（SZ170305）。

作者简介 朱向蕾（1985—），女，河北冀州人，工程师，硕士，从事野生动物科学研究工作。通信作者，工程师，博士，从事野生动物科学研究工作。

收稿日期 2021-04-19

金刚鹦鹉隶属鹦形目鹦鹉科，原产于美洲热带地区，属于大型攀禽，已列入《世界自然保护联盟》（IUCN）濒危物种红色名录。目前国内多家动物园引入饲养金刚鹦鹉，但其繁殖率较低，种群质量堪忧。影响金刚鹦鹉繁殖的因素很多，包括营养、激素水平、气候、温湿度、群体密度以及性别比例等。

性别作为基础信息，是鸟类主要的生物学特征。鸟类性别不仅会影响繁殖配对和育种，而且会对饲养管理、遗传疾病防治、生态学、种群遗传分析以及濒危珍稀鸟类的保护研究等方面具有重要影响[1-2]。然而，世界上超过50%的鸟类属于单态性鸟类，雌雄同型，该类型鸟类无论成鸟还是幼鸟均很难从外观形态上进行性别判定[3]，金刚鹦鹉亦是如此。鹦鹉性别鉴定的方法有很多。吴建民等[4]总结了目前鹦鹉性别鉴定的常用技术方法，包括形态学方法（行为判定、翻肛判定、外科手术判定、排泄物类固醇判定、叫声判定、体尺测量判定、羽色伴性遗传判定等）、细胞生物学方法、分子生物学方法（随机多态性DNA、微卫星、小卫星）等方法。然而，这些方法的成功与否取决于实验室基础设施和研究人员的专业知识及经验积累，有的过程烦琐，耗时较长，因此探索快速、准确、有效的鉴定方法对于珍稀鸟类饲养管理与繁育工作十分必要。

以CHD基因（chromobox-helicase-DNA binding gene）为基础的分子生物学方法已经被广泛应用于非平胸目鸟类的性别鉴定中[5]。CHD基因全称为染色体螺旋蛋白基因，属于功能性基因，非平胸目鸟类有2个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，雄性个体只有1个拷贝CHD-Z;琼脂糖凝胶电泳结果只显示1条条带，雌性个体有2个拷贝CHD-Z和CHD-W，可显示出2条条带，双阳性的带型特征排除了假阴性的可能，结果准确可靠[6]，可作为鸟类性别鉴定的有效方法。

目前，尚未见到国内有针对金刚鹦鹉的性别鉴定相关报道。笔者通过分子生物学手段在已有研究的基础上，采用非损伤性取样的方式快速、准确地鉴定蓝黄金刚鹦鹉（Ara ararauna）和红绿金刚鹦鹉（Ara chloropterus）的性别，以期为今后动物园进一步开展金刚鹦鹉的饲养管理、繁殖育种及物种保护奠定理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集。

采集上海动物园内正常饲养的36只金刚鹦鹉的羽毛，其中蓝黄金刚鹦鹉27只，红绿金刚鹦鹉9只。采集样品均为鸟类胸部羽毛，确保羽根完整，常温干燥保存或-80 ℃下长期冷冻保存。

1.1.2 主要试验设备与试剂。

主要试验设备有凝胶成像系统（Tanon 1600）、PCR仪（Jena Biometra TRIO）、电泳仪（Tanon EPS 300）、电泳槽、移液枪（Eppendorf）等。

主要试剂：MightyAmpTM DNA Polymerase Ver.3 Kit、50 bp DNA Ladder Marker、6× Loading Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。引物2550 F（5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′）和 2718R（5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′）[7]由英潍捷基公司合成。

1.2 PCR反應

应用引物2550F和2817R对CHD基因进行扩增，PCR反应体系为20 μL，各组分浓度按试剂盒推荐体系设置，其中样本DNA剪取1 mm长2～3段羽根，补充ddH2O至20 μL。退火温度为48 ℃，PCR反应在PCR仪上进行。

1.3 琼脂糖凝胶电泳

1.3.1 琼脂糖凝胶的制备。

琼脂糖凝胶浓度为1.5%，用电子天平称取琼脂糖4.5 g，加入锥形瓶中，添加30 mL 1×TAE后将锥形瓶置于微波炉中加热，沸腾直至琼脂糖完全溶解。用流水将锥形瓶中液体冷却至50～60 ℃，加入EB染料4 μL，混匀，倒入凝胶模具中，室温放置30 min以上，备用。

1.3.2 琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增产物中添加6×Loading Buffer 2～3 μL，混匀后取10 μL上样，在1.5%的琼脂糖凝胶上120 V稳压，电泳35 min，电泳完毕后，通过凝胶成像系统进行拍照并记录结果。产物为1条条带的为雄性个体，产物为2条条带的为雌性个体，电泳产物由宝生物工程（大连）有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 羽根样品PCR检测及方法的有效性验证

以已知性别的蓝黄金刚鹦鹉和红绿金刚鹦鹉为例，分别以血液抽提的DNA和羽根样品为模板，利用2550F/2718R引物扩增金刚鹦鹉的CHD基因片段，验证以羽根为样品直接进行PCR检测的有效性和可靠性。

如图1所示，2种金刚鹦鹉的雄性个体均扩增出1条条带，经克隆测序与GenBank数据库中登录序列比对，大小为647 bp;雌性个体均扩增出2条条带，一条为630 bp，另一条为411 bp。2种金刚鹦鹉血液组DNA与羽根样品PCR扩增结果相一致，且与已知性别结果相吻合。从电泳结果来看，以未经核酸提取纯化的羽根为模板扩增得到的PCR产物条带清晰度和产物浓度与血液组DNA相比无明显差异，也无明显非特异性扩增，可用于该种金刚鹦鹉的性别鉴定。

2.2 金刚鹦鹉的性别鉴定

利用引物2550F /2718R对金刚鹦鹉种群中未知性别的个体进行性别鉴定，结果如图2所示。从图2可以看出，条带大小与已知性别条带大小相同，准确率达100%。红绿金刚鹦鹉群体中雌性5只、雄性4只，

雌雄比为5∶4;蓝黄金刚鹦鹉群体中雌性10只、雄性17只，雌雄比为10∶17。

3 讨论

世界上鸟类资源丰富，且大多为单态性鸟类。金刚鹦鹉羽毛色彩鲜丽，深受人们的喜爱，但是其性别无论是幼鸟还是成鸟均很难从外观判别，种群中性别结构难以判定，给繁殖配对造成了一定的困扰，也给鸟类管理和保护、鸟类生态学、行为学研究等方面带来不便，因此鸟类的性别鉴定对于金刚鹦鹉这种珍稀鸟类的繁殖育种、保护研究具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展，利用PCR方法进行鸟类的性别鉴定已取得突破性进展，基于性染色体上特定基因CHD同源拷贝的大小差异，应用PCR技术进行鸟类性别鉴定的方法已经被应用于多种动物保护繁育的研究中。

Griffiths等[8]从小蓝金刚鹦鹉的羽毛中提取DNA，并利用引物（P1、P2、P3）进行PCR扩增，结合限制性内切酶DdeI对其进行性别鉴定，但其花费时间较长。Cerit等[9]利用引物P2/P8对鸡尾鹦鹉进行了性别鉴定，结果发现P2/P8引物对于一些目的片段相近的条带难以区分，亦需要通过限制性内切酶来分离目的条带，过程比较烦琐。胡锐颖等[10]、田秀华等[11]应用引物2550F /2718R对大多数鹤形目、鹳形目鸟类进行了性别鉴定，目前尚未见到将该引物应用于鹦形目鸟类金刚鹦鹉的相关报道。

该研究应用2550F /2718R引物对金刚鹦鹉羽毛样本的CHD-W基因进行PCR扩增，采集样本为非侵入性且不需麻醉即可获得的羽毛，尤其针对金刚鹦鹉这种珍稀鸟类更应避免和减少对鸟类的损伤和应激，且羽毛样本采集、保存和运输等都十分方便，结合分子生物学快速、准确的特点，简化了DNA提取的步骤，使得性别鉴定用时更少，鉴定结果更准确可靠，效率更高，有很好的可靠性，为该物种在分子水平上进行性别鉴定奠定了基础[12-13]。

该研究检测了上海动物园蓝黄金刚鹦鹉和红绿金刚鹦鹉的群体性别结构，其雌雄比分别为10∶17和5∶4，蓝黄金刚鹦鹉中雄性较多，繁殖配对难以均衡，种群中雄性过多也容易引发打斗，尤其是繁殖季节容易造成外伤、应激等不利影响，在一定程度上不利于种群发展，建议优化雌雄比，因为较高的雌性比例更有利于提高种群的繁殖潜力。

参考文献

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