2型固有淋巴细胞与儿童1型糖尿病的相关性▲

胡莹洁

(武汉市第四医院内分泌科，湖北省武汉市 430033)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一种器官特异性自身免疫性疾病，表现为胰岛β细胞破坏或功能衰竭引起的血糖升高，患者需终生依赖胰岛素治疗维持生命。T1DM多发生于青少年，由于多数T1DM患者发病时年龄偏低、自控能力差，使得血糖控制难度较大，其导致的糖尿病酮症酸中毒是1型糖尿病儿童最常见的死亡原因之一，因此研究T1DM的防治手段尤为重要[1]。目前认为T1DM的发生是遗传、免疫、环境等多种因素共同作用的结果，免疫因素可能在T1DM的发展中扮演重要角色并受到越来越多的关注[2]。

人体免疫系统分为固有免疫系统和适应性免疫系统两大类。固有淋巴细胞(innate lymphoid cell，ILC)是固有免疫系统的重要效应细胞群，广泛存在于哺乳动物的皮肤、肺、肠道及脂肪组织等防御屏障，具有介导免疫、协助组织修复重建、调节肠道菌群等多种功能[3]。ILC可根据其表达的特定转录因子和分泌的细胞因子分为三类，即ILC1、ILC2和ILC3。其中，ILC2主要分布于黏膜组织(肺和肠道)、非淋巴器官(肝、肾和内脏脂肪组织)、淋巴器官(脾、骨髓)及血液，在宿主防御、组织修复及抵抗炎症性疾病中发挥重要作用[4]。ILC2主要介导Th2类免疫应答，并可以通过多种效应细胞因子调控不同信号通路，参与哮喘、特异性皮炎、嗜酸性胃肠炎等多种免疫性疾病的发生[5]。ILC2作为单独的细胞亚群，在激活的状态下可迅速产生Th2细胞相关的细胞因子和其他效应分子，包括白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13和表皮生长因子受体配体双向调节因子，并通过这些细胞因子驱动2型免疫反应的发生[6]。本研究通过分析T1DM患儿与正常儿童ILC2及相关细胞因子的表达差异，初步探讨ILC2与T1DM的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2020年1月于武汉市第四医院住院的20例T1DM患儿为T1DM组。纳入标准：(1)年龄8～18岁；(2)符合1999年世界卫生组织制定的1型糖尿病诊断标准[7]。排除标准：(1)2型糖尿病患儿；(2)合并糖尿病急性并发症，如糖尿病酮症、酮症酸中毒、高血糖高渗状态；(3)患有T1DM以外的其他自身免疫性疾病；(4)有遗传病家族史。另选取同期来武汉市第四医院体检中心体检的20名健康儿童为正常对照组。纳入标准：(1)年龄8～18岁；(2)无糖尿病及糖调节受损；(3)尿糖阴性。排除标准：(1)患有自身免疫性疾病；(2)有遗传病家族史。本研究经武汉市第四医院医学伦理委员会审核通过，研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般资料：收集两组儿童的年龄、性别、血压。

1.2.2 生化指标检测：于T1DM组患儿入院时采集其空腹肘静脉血5 mL，于正常对照组儿童在体检时采集其空腹肘静脉血5 mL，采用己糖激酶法检测空腹血糖及餐后2 h血糖，采用氧化酶法检测总胆固醇、三酰甘油，采用直接法检测LDL-C、HDL-C，使用ADVIA 2400全自动生化分析仪(Siemens公司)检测上述指标，严格按照试剂盒(重庆中元生物技术有限公司，批号：H200905、H201109、H201008、H201203、H201106；积水医疗科技有限公司，批号：841RIS)说明书进行检测。采用高效液相色谱法检测HbA1c，检测仪器为伯乐D-10糖化血红蛋白仪(试剂盒：伯乐实验室有限公司，批号：64431018)。

1.2.3 外周血单个核细胞的分离：于T1DM组患儿入院时采集其空腹肘静脉血3 mL，于正常对照组儿童在体检时采集其空腹肘静脉血3 mL，经肝素钠抗凝后，在室温下1 500 r/min离心10 min。离心结束后将下层细胞沉淀物移至50 mL离心管中，并加入PBS稀释，用无菌吸管小心吸取白色细胞层置于另一无菌离心管(已事先加入等体积单核细胞分离液)，室温下2 500 r/min离心25 min，加入适量PBS，1 500 r/min离心10 min，得到的白色沉淀即为外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.4 流式细胞术检测PBMC中的ILC2水平：取200 μL PBMC悬液至流式细胞仪上机管，加入5 μL鼠抗人CD45抗体、5 μL鼠抗人CD127抗体、5 μL鼠抗人CD294抗体及人Lineage复合抗体(由CD2、CD3、CD4、CD7等组成)，以上抗体均购自伯乐实验室有限公司。充分混匀，室温避光孵育40 min。将Lineage-CD45+CD127+CD294+细胞判定为ILC2，采用流式细胞仪分析ILC2占PBMC的比例。上述实验设置3个复孔。

1.2.5 ELISA 检测：于T1DM组患儿入院时采集其空腹肘静脉血2 mL，于正常对照组儿童在体检时采集其空腹肘静脉血2 mL，常温下3 000 r/min离心20 min，收集上清液。采用 ELISA测定血清IL-4、IL-5和IL-13水平。ELISA试剂盒购于上海恒远生化试剂有限公司(批号：20200708、20200802、20200907)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例数表示，比较采用χ2检验；指标间的相关性采用Pearson检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料及生化指标的比较 两组的性别、年龄、收缩压、舒张压及总胆固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。与正常对照组相比，T1DM组的空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均升高(均P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料及生化指标的比较

2.2 两组ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较 与正常对照组比较，T1DM组ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(均P<0.05)。见表2。

表2 两组ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较(x±s)

2.3 T1DM患儿ILC2占PBMC的比例与一般资料、生化指标及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的相关性分析 T1DM患儿ILC2占PBMC的比例与年龄、收缩压、舒张压及总胆固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平之间均无相关性(均P>0.05)，但ILC2占PBMC的比例与空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c及血清IL-4、IL-5、IL-13水平之间均呈正相关(均P<0.05)。见表3和表4。

表3 T1DM患儿ILC2占PBMC的比例与一般资料、生化指标的相关性

表4 ILC2占PBMC的比例与血清IL-4、IL-5及IL-13水平的相关性

3 讨 论

ILC2是近年来发现的一类重要的ILC亚群，它由骨髓中的淋巴祖细胞在转录因子DNA结合抑制剂2、RAR相关孤儿受体α(RAR related orphan receptor alpha,RORα)和GATA结合蛋白3的调控下产生，是小鼠和人类2型免疫反应的中枢调节因子之一[8]。有学者指出，ILC2通过分泌2类细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13来参与宿主防御、组织修复及抵抗炎症性疾病[9]。目前关于 ILC2在自身免疫性疾病、过敏性疾病中的研究受到越来越多的关注。

ILC主要分布在肠黏膜，可以调节肠道稳态和保护肠黏膜的完整性。Monticelli等[10]的研究表明，ILC2在肠道中发挥屏障保护作用，在肠道受损时，IL-33/双向调节因子(amphiregulin,AREG)/表皮生长因子受体信号通路可能通过ILC2抑制炎症和/或促进上皮修复。有研究显示，IL-33作为一种细胞因子“警报”，可在上皮细胞损伤时激活肺和肠的常驻免疫细胞亚群；IL-33是诱导体内ILC2中AREG表达的有效刺激因子，特别是在肠道中，IL-33 通过诱导肠道中ILC2的表达从而促进AREG的分泌[11]。该研究还显示，IL-33可诱导不同功能的ILC2群体，同时表达IL-5、IL-13和/或AREG，提示ILC2亚群参与调节肠道表面屏障的炎症反应[11]。还有学者在恶唑酮诱导的肠道损伤模型中观察到，IL-25可诱发与疾病严重程度相关的IL-13和ILC2的表达，这表明在某些情况下ILC2可能参与肠道损伤时的炎症反应[12]。

国外有关ILC过度活化后诱导炎症因子产生而引发自身免疫性疾病的研究，多集中在肠道疾病及皮肤疾病领域。研究显示，在克罗恩病患者肠道内，ILC1表达升高，ILC1过度活化后通过分泌γ干扰素加重肠道的炎症水平，而持续的炎症会引起炎性肠道疾病[13-14]，肠道菌群参与ILC的分化，同时ILC可通过产生不同类型的细胞因子影响肠道菌群组成[15]。还有学者发现，肠道菌群产物芳香烃受体配体和丁酸可以促进胰腺中的ILC分泌IL-23和IL-22，后两者诱导胰腺分泌细胞表达甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二苷酸结合域蛋白14，如果肠黏膜固有层存在ILC并分泌IL-22，将影响免疫炎症反应与免疫耐受之间的平衡，推测此机制在肠道炎症的迁延、复发、扩散中起关键作用[15]。此外，Kim等[16]首次发现ILC2 在人及小鼠中均参与了特应性皮炎的发病过程，表面标志为Lineage-CD25+IL-33R+的ILC2在特应性皮炎皮损中聚集，从特应性皮炎皮损区分离得到的ILC2可以表达前列腺素D2受体及CD161，但从正常皮肤分离得到的ILC2并不表达前列腺素D2受体及CD161。

张淡宜等[17]的研究表明，桥本甲状腺炎患者外周血中IL-5、IL-13水平升高。IL-13被认为是抗炎细胞因子，同时又是强促纤维化因子，其可以表现出不同的生物学功能，最终的效应是促进炎症消退或者介导病理应答，在哮喘患者中IL-13是介导气道高反应性和黏膜高分泌的主要介质[18]。有学者通过实时荧光定量PCR检测发现，桥本甲状腺炎患者PBMC中RORα、IL-5、IL-13水平均明显升高，相关性分析显示RORα和IL-13呈正相关[19]。RORα是调控ILC2的特征性转录因子，对维持ILC2分化和功能起到重要作用。进一步对外周血循环中ILC2表达水平与抗体数量的相关性进行分析，发现RORα与抗甲状腺过氧化物酶抗体、抗甲状腺球蛋白抗体呈正相关，IL-5也与抗甲状腺过氧化物酶抗体呈正相关，IL-13与抗甲状腺过氧化物酶抗体、抗甲状腺球蛋白抗体呈一定的正相关趋势[19]。这提示ILC2 活性增强可能是桥本甲状腺炎发病的重要免疫学机制。

通过上述研究可知，ILC2调节机制在自身免疫疾病中具有重要作用，炎症因子表达升高可促进ILC分化，从而导致自身免疫性疾病的发生，但其具体机制尚存在争议。本研究结果显示，T1DM患儿PBMC中的ILC2比例增高，并且T1DM患儿血清IL-4、IL-5、IL-13水平高于健康儿童，且T1DM患儿的ILC2占PBMC的比例与血清IL-4、IL-5、IL-13水平呈正相关(均P<0.05)，提示T1DM患儿存在体内ILC2增加，且炎症反应增强，ILC2可能通过与炎症因子相互作用，在T1DM发病过程中起到关键作用。本研究行进一步相关性分析，结果显示，T1DM患儿ILC2占PBMC的比例与空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均呈正相关(均P<0.05)，提示ILC2可能参与T1DM的病情进展。

综上所述，T1DM患儿体内ILC2增加，其与患儿的血糖控制水平及炎病水平呈正相关，ILC2可能通过与炎症因子相互作用，参与T1DM的发生和发展，ILC2有可能成为T1DM潜在的治疗靶点。但由于本研究临床样本量小，未涉及具体作用机制的研究。今后可通过动物实验来进一步明确ILC2与Th2类细胞因子之间的上下游关系，从而阐明ILC2参与T1DM发病的分子机制。