三阴性乳腺癌细胞裂解物通过PD1/PDL1相互作用抑制免疫细胞活性①

陈文利 黄新亮 刘 辉 周小楠 潘中武 董博翰 （皖南医学院生物化学教研室，芜湖241000）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国乳腺癌的发病率居于世界首位［1-2］。在各种病理类型的乳腺癌中，三阴性乳腺癌侵袭性最强，且预后较其他类型较差，目前的治疗效果也不甚理想［3］。随着现代科学的不断进步，抗肿瘤免疫疗法已逐渐应用于各种癌症的治疗，并显示了较好的治疗效果［4］。其中肿瘤细胞裂解物（tumor cell lysate，TCL）是抗肿瘤免疫治疗中常用的免疫细胞激活物。TCL含有肿瘤细胞中的各种肿瘤抗原和免疫活化蛋白因子，可诱导抗肿瘤免疫的发生，从而治疗肿瘤［5］。但TCL在实际应用过程中也面临免疫激活能力不够强，甚至可能诱导免疫细胞凋亡的问题，这可能同TCL 中也存在免疫抑制物质有关［6］。程序性死亡因子1（programmed cell death protein 1，PD1)是公认的免疫检查点分子，其配体细胞程序性死亡配体1（pro‑grammed cell death protein ligand 1，PDL1）在多种癌症中高度表达，PD1 与PDL1 结合，可引发PIK3CA/AKT 等信号通路的抑制，传导负性调节信号，向下调节抗肿瘤、抗感染免疫，产生免疫逃逸促进肿瘤发生［7-11］。因此，TCL 对免疫细胞的活性产生的负面影响以及这种影响是否同PD1/PDL1 相互作用启动免疫检查机制有关值得探索。本研究将三阴性乳腺癌TCL 作用于T 淋巴细胞系H9，并用不同剂量的PD1/PDL1 抑制剂共同处理H9 细胞，以此探讨TCL本身以及抑制剂PDL1 与PD1 结合后对H9 细胞活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 化学发光成像系统（中国Clinx）；流式细胞仪（贝克曼CytoFLEX）；酶标仪（美国Thermo）。

1.1.2 试剂 DMEM 培养液（美国Gibco）；胎牛血清（乌拉圭Lonsera）及双抗，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG 二抗（中国碧云天）；PD1/PDL1 抑制剂（美 国Selleck，PD1/PDL1 Inhibitor 3）；PD1 抗 体、PDL1 抗体及GAPDH 抗体、TNF-β 细胞因子检测试剂盒（中国ABClonal）；PE 标记的CD69 单克隆抗体（美国Thermo Fisher Scientific）；细胞凋亡检测试剂盒（中国凯基）；IL-2、IL-4（中国依科赛）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将MDA-MD-231 细胞及MCF-10A 细胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素的DMEM 培养液中培养。H9 细胞于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素的RPMI1640培养基中培养。每1～2 d换液1次，3～5 d 传代1 次。细胞培养于5%CO2、37 ℃培养箱中，取对数生长期细胞进行实验。PBMC 取自正常人外周血，采用人淋巴细胞分离液经过简单分离得到，伦理审批批号为：2020论审国研第（87）号。

1.2.2 231-TCL 的制备 取对数生长期的MDAMD-231 细胞计数并溶于PBS 溶液，每1×107个细胞溶于1 ml PBS，分别于-80 ℃冷冻15 min，于37 ℃融化5 min，振荡1 min，为1个循环；反复冻融细胞5次。采用台盼蓝染色法检测细胞冻融破裂情况，细胞全部死亡即为冻融细胞完成，得到231-TCL。

1.2.3 Western blot 检测 收集各细胞后用适量裂解液裂解细胞，BCA 法测定蛋白浓度后，于10%的SDS-PAGE 分离蛋白，转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭膜，4 ℃湿盒中孵育相应的一抗过夜，TBST 洗膜，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG 二抗于室温下孵育1.5 h，洗膜，避光条件下用适量化学发光液铺展在膜上，于化学发光仪上显影。通过Image J 软件分析目的蛋白相对于GAPDH蛋白的灰度值。

1.2.4 细胞凋亡检测 以2.5×105个H9 细胞接种于12 孔板，待H9 细胞稳定后加入不同剂量（MDAMD-231细胞数：H9细胞数分别为0.125：1、0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1）的231-TCL，分别孵育24 h、48 h、72 h后收集细胞用于检测231-TCL不同剂量对H9 细胞凋亡的影响；或加入同一剂量（MDA-MD-231 细胞数：H9 细胞数为2：1）的231-TCL 并加入不同剂量的PD1/PDL1 抑制剂，孵育48 h 后收集细胞用于检测抑制剂作用后的231-TCL 对H9 细胞凋亡的影响。收集细胞后用PBS 洗涤2 次，再将其重新悬浮在500 μl 染色缓冲液中，用碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V（Annexin V）对细胞进行避光染色15 min，在1 h内用流式细胞仪测细胞凋亡。

1.2.5 细胞活化检测 以2.5×105个H9 细胞接种于12 孔板，待H9 细胞稳定后加入同一剂量的231-TCL 并加入不同剂量的PD1/PDL1抑制剂，孵育48 h后收集细胞，并用PBS 洗涤细胞2 次，再将其重新悬浮在500 μl 染色缓冲液中，用PE 标记的CD69 染料对细胞进行避光染色15 min，在1 h内用流式细胞仪收集细胞检测CD69。

1.2.6 ELISA 检测 以2.5×105个H9 细胞接种于12 孔板，待H9 细胞稳定后加入同一剂量的231-TCL，孵育48 h 后收集上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行IL-2、IL-4、TNF-β细胞因子检测。

1.3 统计学处理 利用SPSS18.0统计学软件进行数据处理，所有实验数据使用单因素差异分析法来进行分析。如两样本均数方差齐，采用t 检验进行比较；如两样本均数方差不齐，采用秩和检验或方差分析进行比较。对于两个独立样本率，采用卡方检验进行比较。P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDL1 在MDA-MD-231、MCF-10A 细胞中及在H9、PBMC 中的表达 Western blot 结果显示，MDAMD-231 细胞、MCF-10A 细胞中均可见PDL1 蛋白表达（图1A），其中MDA-MD-231 细胞中PDL1 蛋白含量明显较高（P＜0.01）；在H9细胞和PBMC中也检测到PD1 蛋白存在（图1B），在GAPDH 含量不变的情况下，H9 细胞中PD1 蛋白表达升高（P＜0.01）。其中，阴性对照BSA 中未见条带，说明该PDL1 抗体和PD1抗体为特异性抗体。

图1 MDA-MD-231、MCF-10A 细 胞 中PDL1 表 达 及H9细胞、PBMC中PD1表达Fig.1 PDL1 expression in MDA-MD-231 and MCF-10A cells and PD1 expression in H9 cells and PBMC

2.2 231-TCL诱导H9细胞凋亡的剂量-时间摸索通过流式凋亡检测发现，在24 h、48 h、72 h 3个时间点下，H9 细胞的凋亡大致遵循剂量依赖关系，随着231-TCL 剂量逐渐增加，细胞凋亡增加（P＜0.01）。其中在24 h 作用时间点，231-TCL 在与H9 细胞数量比例为1：1、2：1、3：1 时，凋亡数基本无变化；在48 h作用时间点，231-TCL 在与H9 细胞数量比例为2：1时，凋亡数最多；而在72 h 作用时间点，仍然是细胞数量比例为2：1 时凋亡最高，但231-TCL 诱导H9 的凋亡数整体偏低（图2）。综合以上结果，选择231-TCL 与H9 细胞比例为1：2，作用时间48 h 为最佳剂量-时间进行后续实验。

图2 231-TCL诱导H9细胞凋亡Fig.2 231-TCL induces H9 cell apoptosis

2.3 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用对H9细胞凋亡的抑制作用 为了验证231-TCL 中PDL1对H9 细胞凋亡的影响，使用PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用H9 细胞，检测H9 细胞的凋亡情况。流式结果表明，231-TCL 使H9 细胞凋亡明显增加（P＜0.01）。然而，PD1/PDL1 抑制剂共同作用后的H9 细胞，在低剂量5.6 nmol/L 时，细胞凋亡略有增加；随着剂量增加，凋亡逐渐减少；但是当剂量到达112 nmol/L 后，H9 细胞凋亡有明显增加趋势（P＜0.01），见图3。

图3 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用抑制H9 细胞凋亡Fig.3 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor inhibit H9 cell apoptosis

2.4 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用对H9细胞的活化作用 为了验证231-TCL 中PDL1 对H9细胞活性的影响，使用PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL共同作用H9细胞，检测H9细胞的活化情况，结果见图4。流式结果表明，231-TCL 可对H9 细胞具有一定的活化作用（P＜0.01）。当231-TCL 与PD1/PDL1抑制剂共同作用后，随着剂量增加，H9 细胞的活化逐渐增加；但当剂量到达112 nmol/L 后，H9 细胞活化效果有下降趋势。

图4 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用促进H9 细胞活化Fig.4 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor promote H9 cell activation

2.5 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用对H9细胞分泌IL-2、IL-4、TNF-β 细胞因子的影响 收集231-TCL 与PD1/PDL1 抑制剂共同作用H9 细胞的上清液，应用ELISA 实验检测上清液中的细胞因子情况，结果如图5A、B 所示，231-TCL 可促进H9 细胞分泌IL-2、TNF-β，当231-TCL与PD1/PDL1抑制剂共同作用H9细胞后，IL-2和TNF-β的分泌也有一定程度的增高（P＜0.05），剂量高于112 nmol/L 时差异均有统计学意义（P＜0.05），且IL-2 中效果最佳。作用前后IL-4的分泌并无明显变化（图5C）。

图5 PD1/PDL1 抑制剂与231-TCL 共同作用影响H9 细胞因子分泌Fig.5 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor affect H9 cell cytokine secretion

3 讨论

乳腺癌在我国有较高的发病率，并且具有相当高的病死率，但目前的临床治疗效果不佳［12］。研究发现，通过TCL 可以致敏免疫细胞，进而产生抗肿瘤免疫作用［13］，因此如何让TCL 更好的活化免疫细胞，是基于TCL 的抗肿瘤方法有效应用的关键。TCL 作为细胞内各种内容物的混合物，其中包含免疫活化物质，同时也势必含有免疫抑制成分。本研究着眼于免疫检查点分子PD1及其配体PDL1，探讨三阴性乳腺癌TCL 通过PD1/PDL1 的相互作用对T淋巴细胞系H9细胞活性及功能产生的影响。

首先通过Western blot 检测发现，三阴性乳腺癌细胞MDA-MD-231 中PDL1 表达明显高于正常乳腺细胞MCF-10A，同时H9 中PD1 蛋白表达也明显高于正常人PBMC。由于MDA-MD-231 细胞中PDL1蛋白的表达量较高，利用其制备的231-TCL 中也一定含有大量的PDL1 分子。而H9 细胞高表达PD1，则证明H9 细胞中存在PD1 免疫检查机制启动的分子基础。

TCL 是抗肿瘤免疫治疗中常用的免疫活化剂，但过去的研究发现肺癌细胞TCL 也能诱导免疫细胞凋亡［14］。本研究也发现了类似的现象，三阴性乳腺癌细胞MDA-MD-231 制备的231-TCL，能在适当的比例和作用时间下诱导T 淋巴细胞系H9 凋亡。凋亡的发生会使体外培养的H9 中的为TCL 激活的“有效细胞”数目大为减少，真正能转变生成的抗肿瘤免疫细胞，因此也会出现下降，这十分不利于抗肿瘤免疫作用的产生。而且，TCL 如果能诱导T 细胞凋亡，也极有可能同时诱导抗原提呈细胞、NK 等细胞发生凋亡，TCL 抗肿瘤的实用效果会被严重削弱。如何消除TCL 的这种凋亡诱导作用，显得尤为重要。

为改善231-TCL的免疫活性，将PD1/PDL1抑制剂与231-TCL 共同作用于H9细胞，然后应用流式细胞术检测，结果显示：抑制剂剂量直至112 nmol/L时，H9 细胞凋亡呈剂量依赖性逐渐减少。这说明当设法阻止231-TCL 中的PDL1同H9细胞上的PD1结合后，免疫细胞的凋亡会出现减少。PDL1应该是TCL诱导H9 凋亡的关键物质。此外，当抑制剂剂量高于112 nmol/L后，凋亡有升高趋势。说明112 nmol/L应该是抑制PD1/PDL1 相互作用的最佳剂量，而高浓度的抑制剂本身对免疫细胞有一定的伤害作用，可能也诱导了部分凋亡［15］。同上述诱导凋亡的结果相类似，PD1/PDL1 抑制剂联合231-TCL 可以促进H9细胞表面CD69的表达、活化免疫细胞，抑制剂剂量到达112 nmol/L 时活化效果达到顶峰。CD69 是T 淋巴细胞激活后早期表达的表面抗原，当其表达后，可作为共刺激信号促进T 细胞进一步活化和增殖，通过检测CD69 可以验证T 淋巴细胞是否被活化［16］。上述结果证明，231-TCL 中的PDL1 可诱导H9细胞凋亡、降低其活化；当抑制了TCL中PDL1和H9 表面PD1 的结合，H9 细胞凋亡减少、活化增加，细胞活力得以显著改善。

H9 细胞是一种CD4+T 淋巴细胞，其免疫学功能主要通过合成分泌细胞因子体现。因此，应用ELISA 法检测了H9 细胞因子的分泌量，发现231-TCL 作用H9 细胞后，细胞培养上清液中细胞因子IL-2，TNF-β 分泌增加，说明231-TCL 本身可以活化免疫细胞。当加入PD1/PDL1 抑制剂后，细胞因子IL-2，TNF-β 分泌进一步增加。IL-2 主要由活化T 细胞产生，可刺激T 细胞生长、活化，并诱导CD4+T 细胞分化为Th1 辅助细胞，增强细胞免疫的杀伤作用［17-18］；TNF-β 是活化T 细胞和B 细胞产生，参与多种生物调节，包括细胞凋亡、增殖、分化等，可直接杀伤肿瘤细胞等，从而抑制肿瘤的发展，这种细胞因子可以活化DC、巨噬细胞等抗原提呈细胞，促进这些细胞有效参与细胞免疫应答［19］。总的来说，IL-2和TNF-β的分泌有利于细胞免疫的发生。抑制231-TCL 中的PDL1 和H9 细胞PD1 结合后，IL-2、TNF-β分泌量进一步增加的结果说明：231-TCL 中的PDL1对T 淋巴细胞所介导的细胞免疫应答是有抑制作用，抑制PDL1 和PD1 的结合则有助于细胞免疫应答的恢复。考虑到细胞免疫应答是机体抗肿瘤的最主要方式，因此，PD1/PDL1 抑制剂和TCL 的联合应用或许可以诱导更强的抗肿瘤免疫作用。除了IL-2、TNF-β，还检测了细胞因子IL-4，但是IL-4分泌量几乎没有变化。IL-4 也可由活化T 细胞产生，但其免疫学功能与IL-2 有所不同，主要增强体液免疫途径［20］。细胞因子IL-4 分泌无明显变化表明：TCL中的PDL1 与PD1 结合后，主要会影响后续细胞免疫应答的发生，而非体液免疫应答。体液免疫并不是最主要的抗肿瘤免疫作用，因此体液免疫没有增强，并不会显著影响PD1/PDL1 抑制剂和TCL 联用所诱导的抗肿瘤免疫作用。

综上，研究发现三阴性乳腺癌TCL本身对H9细胞具有活化和促凋亡的双重作用。TCL 中PDL1 的存在有碍于TCL 发挥免疫活化作用，这同TCL 中的PDL1与H9细胞的PD1结合，并诱导细胞凋亡有关。将PD1/PDL1 抑制剂与TCL 联用则能显著提高TCL对H9 细胞的活化作用。这提示在体内外使用TCL活化各种免疫细胞时，均可考虑加入PD1/PDL1 抑制剂，这是一种提高TCL 免疫活性的新颖有效的方式。在此基础之上，今后还可进一步对TCL 通过PD1/PDL1 抑制免疫细胞功能的下游分子机制进行研究，进而通过靶向PD1/PDL1 免疫检查点通路优化TCL 对免疫细胞的活化，如将PD1/PDL1 信号通路中的信号分子抑制剂与TCL 联用，以更好地活化免疫细胞。上述多种方式，均有望提高TCL 的抗肿瘤效果，可为临床上三阴性乳腺癌治疗提供更多的参考和解决方案。