参苓白术散对脾虚湿困型UC大鼠结肠组织MKK/JNK通路的影响①

柴瑞婷 贾育新 张明雨 王 斑 范珉珏 曹思齐 （甘肃中医药大学，兰州730000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见多发的慢性非特异性炎症性肠病，临床多表现为反复发作的腹泻、腹痛、黏液脓血便，病变部位多在结肠黏膜及黏膜下层，逐渐向全结肠蔓延［1］。UC 的发病机制尚未完全明确，有研究表明，免疫、环境、遗传和外部感染等均可导致UC 发病，目前多数研究者认为黏膜免疫异常是引发肠道炎症的关键，而治疗UC 的主要原则是控制症状、减轻炎症反应、促进黏膜愈合、防止复发、防治并发症等［2］。西医学主要通过氨基水杨酸盐、免疫调节剂及糖皮质激素等治疗，然而长期用药存在明显的不良反应［3-4］。中医认为UC 多为素体脾气虚弱、饮食不调、感受外邪所致，病位在大肠，与脾、肝、肾密切相关，脾虚湿困证为其重要证型之一，治以参苓白术散［5］。本文拟研究参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠血清和结肠组织中IL-2 和IL-17 含量、结肠组织中MKK4/7、JNK、AP-1 蛋白及mRNA 表达的影响，探讨参苓白术散对模型大鼠MKK/JNK 信号通路的干预作用，进一步挖掘参苓白术散治疗脾虚湿困型UC的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 72 只2 月龄SPF 级健康Wistar大鼠（雌雄各半），体质量（220±10）g，由甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2015-0002，于甘肃中医药大学SPF 级实验室常规饲养［动物设施使用许可证号：SYXK（甘）2015-0005-0001405］，相对湿度45%～55%，室温22～25 ℃，自由进食饮水。实验动物处理遵守实验动物伦理原则（伦理审查编号：2019-166）。

1.1.2 药物 参苓白术散配方颗粒原料药材根据《中国药典》依法炮制，按原处方比例配伍（由人参：炒白术：白茯苓：甘草：薏仁：莲子：砂仁：白扁豆：桔梗：山药=4：4：4：4：2：2：2：3：2：4），由甘肃中医药大学附属医院制剂室加工提供；美沙拉秦肠溶片（黑龙江天宏药业股份有限公司，批号：20190202）。

1.1.3 主要试剂与仪器 2，4，6-三硝基苯磺酸（美伦生物，批号：D1010A）；RIPA 裂解液PMSF（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：20200701）；脱脂奶粉（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：224Q056）；电泳凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20171206）；大鼠IL-2、IL-17 ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：07/2020、07/2020）；逆转录试剂盒（批号：H2901291）；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（批号：H8901070）；一抗MKK4、MKK7、JNK、AP-1（美国Abcam 公司，批号：GR297166-6、GR294192-3、GR326430-1、GR156116-12）；p-MKK4（Ser257）、p-JNK（Thr183/Tyr185）、p-AP-1（Ser73）（Cell Signaling Technology 公司，批号：4514T、4668T、3270T）；p-MKK7（Thr275，Affinit公司，批号：#27x6428）；GAPDH一抗（Immunoway 公司，批号：YM3215）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，批号：56j9956）。

SCIENTZ-48型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CT14RD 型高速低温离心机（上海天美生化仪器设备工程公司）；Chemi DOC XRS+型凝胶成像分析系统、10705 型Benchmark Plus 酶 标 仪、CFX96 型Real-time PCR 仪、S1000TM型逆转录仪、SD 型Western blot 电泳及转印系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备 72 只Wistar 大鼠适应性喂养1 周后，随机分为空白组（12 只）和造模组（60 只），造模组采用病证结合综合法复建脾虚湿困型UC 大鼠［6-7］。按随机数字表法将造模组分为模型组、美沙拉秦肠溶片对照组和参苓白术散高、中、低剂量组，每组12只。

模型制备：造模组大鼠单日禁食不禁水，给予4 ℃冷水（2 ml/只）灌胃1 次，双日供应充足饲料，并给予猪油（4 ml/只）灌胃1次，如此交替，每日强迫大鼠站于2 cm 深水中8 h，连续20 d；第21 天禁食不禁水24 h 后，以10%水合氯醛腹腔麻醉（3 ml/kg），将16 号灌胃针头部涂抹凡士林后，插入大鼠肛门8 cm处，空白组以0.25 ml生理盐水灌肠，造模组以0.25 ml 100 mg/kg TNBS+50%乙醇混合试剂灌肠，倒提大鼠尾部静置1 min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔，随后将大鼠头部倾斜向下躺至自然苏醒，自由饮食。观察大鼠体征是否出现脓血便、腹泻等，并随机抽取病检，确保造模成功。

1.2.2 给药方法与标本采集 参苓白术散高、中、低剂量组分别按颗粒剂［27.9、13.95、6.975 g/（kg·d）］灌胃，对照组以0.2 g/（kg·d）灌胃21 d（大鼠的等效剂量相当于70 kg成人剂量的6.3倍）。末次给药禁食不禁水24 h，麻醉采血，血样静置15 min，3 000 r/min离心15 min，取血清于-80 ℃保存；脱颈处死，取胸腺、脾脏称重，截取肛门上约8 cm 处结肠组织，部分置于4%多聚甲醛固定液待病检，部分于-80 ℃保存待测基因蛋白。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 观察指标 观察各组大鼠精神状态、毛色、活动情况及大便性状的改变；肉眼观察大鼠结肠组织黏膜损伤程度。

1.2.3.2 免疫器官指数 剥离胸腺和脾脏，生理盐水冲洗，滤纸滤干残血后称重。胸腺指数（mg/g）=胸腺重量（mg）/大鼠体质量（g）；脾脏指数（mg/g）=脾脏重量（mg）/大鼠体质量（g）。

1.2.3.3 结肠组织病理检测 将病变明显的结肠组织固定于4%多聚甲醛，避光保存，石蜡常规包埋、切片，进行HE 染色，高倍显微镜下（×200）观察各组溃疡大小、炎症浸润。

1.2.3.4 ELISA 检测结肠组织和血清中IL-2、IL-17含量 取制备的组织上清及血清并平衡至室温，严格按照ELISA 试剂盒操作说明进行，酶标仪波长450 nm处读取OD值，计算样品含量。

1.2.3.5 RT-PCR 检 测 结 肠 组 织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 表达水平 称取结肠组织样本0.1 g，Trizol 法提取总RNA，微量分光光度计检测RNA 浓度及纯度。按逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA 并扩增。相对基因表达量采用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH 为内参，引物由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.3.6 Western blot 检测结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白相对表达量 称取结肠组织0.1 g置于离心管中，加入裂解液500 μl（10 μl PMSF+490 μl RIPA），剪碎、匀浆，充分裂解后，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，收集上清液300 μl，加入4 倍上样缓冲液100 μl，100 ℃水浴10 min。根据MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白相对分子量进行SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，加入稀释的GAPDH（1：1 000）、MKK4（1：500）、p-MKK4（1：200）、MKK7（1：500）、p-MKK7（1：500）、JNK（1：1 000）、p-JNK（1：500）、AP-1（1：1 000）、p-AP-1（1：500）一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次×10 min。加入稀释的二抗（1：10 000）室温孵育2 h，TBST洗涤3次×10 min，ECL显色液1：1 显影后采用Image J 图像分析软件进行目的条带的灰度光密度分析。磷酸化蛋白以总蛋白表达水平为参照，通过计算磷酸化蛋白和总蛋白比值显示蛋白活化情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以±s表示，组间差异的比较采用方差分析，若方差齐采用LSD 法，方差不齐采用Tamhane'sT2法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及免疫器官指数变化比较

2.1.1 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠一般状态的影响 空白组大鼠毛色光亮，精神状态良好，喜活动，大便呈完整颗粒状；模型组大鼠皮无泽易脱，精神倦怠，拱背扎堆，食水量较空白组明显减少，大便黏腻，出现脓血便，肛周污秽；药物干预后，与模型组相比，药物治疗各组大鼠上述症状均有明显好转，其中以参苓白术散高剂量组最为显著。

2.1.2 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠免疫器官指数的影响 与空白组相比，模型组大鼠胸腺指数明显降低（P＜0.01），脾脏指数明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，参苓白术散各组和美沙拉秦对照组大鼠胸腺指数均有所上升，脾脏指数均有所下降，其中参苓白术散高剂量组最为显著（P＜0.01）；与美沙拉秦肠溶片对照组相比，参苓白术散各剂量组免疫器官指数差异均无统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠胸腺指数和脾脏指数的影响Fig.1 Effects of Shenlingbaizhu Powder on thymus index and spleen index of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.2 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织病理形态的影响

2.2.1 结肠组织宏观观察 肉眼观空白组大鼠结肠组织肠壁完整光滑，纹理清晰，未见溃疡点、糜烂、充血、水肿等。模型组大鼠结肠黏膜明显水肿充血，肠壁增厚且凹凸不平，溃疡明显，可见黑褐色坏死组织。参苓白术散高剂量组结肠组织无明显水肿、充血等，表面相对完整，肠壁较空白组略厚，颜色略深。其他治疗组大鼠结肠组织不同程度地恢复（图2）。

图2 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织的影响（宏观）Fig.2 Effect of Shenlingbaizhu Powder on colonic tissue of UC rats with spleen deficiency and dampness（on macro）

2.2.2 结肠组织病理切片观察 镜下观察空白组大鼠结肠组织黏膜结构完整清晰，肠腺规则，隐窝无坏死，可见大量杯状细胞，无炎症细胞浸润。模型组大鼠结肠组织黏膜结构破坏，肠腺缺失，黏膜表面不平，形成隐窝脓肿，杯状细胞减少，细胞内黏液减少，固有膜间质内可见大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞、浆细胞和单核细胞为主。参苓白术散高剂量组大鼠结肠黏膜结构基本恢复，肠腺破坏较轻，可见再生的黏膜上皮及肠腺，炎症细胞浸润明显减少。其他治疗组大鼠结肠组织黏膜少量恢复，仍有少量炎症细胞浸润（图3）。

图3 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织病理形态的影响（HE，×200）Fig.3 Effect of Shenlingbaizhu Powder on pathological morphology of colon in UC rats with spleen deficiency and dampness（HE，×200）

2.3 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠血清及结肠组织中IL-2、IL-17 含量的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-2和IL-17含量升高（P＜0.01），结 肠 组 织 中IL-2、IL-17 含 量 升 高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，参苓白术散各剂量组和美沙拉秦肠溶片对照组血清及结肠组织中IL-2、IL-17 含量均降低，其中以参苓白术散高剂量组差异最为显著（P＜0.01）；与美沙拉秦肠溶片对照组相比，参苓白术散低剂量组结肠中IL-17 含量差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图4 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠血清和结肠组织中IL-2、IL-17含量的影响Fig.4 Effect of Shenlingbaizhu Powder on contents of IL-2 and IL-17 in serum and colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.4 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 水平的影响 与空白组相比，模型组大鼠结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，各干预组大鼠结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA表达水平均有不同程度降低，其中参苓白术散高剂量组效果最显著（P＜0.01）；与美沙拉秦肠溶片对照组相比，除参苓白术散高剂量组外，参苓白术散中、低剂量组差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图5）。

图5 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织中MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA水平的影响Fig.5 Effect of Shenlingbaizhu Powder on MKK4，MKK7，JNK，AP-1 mRNA levels in colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.5 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 表达及磷酸化水平的影响 与空白组相比，模型组大鼠结肠组织p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7 和p-AP-1/AP-1 显著升高（P＜0.01），p-JNK/JNK 亦升高（P＜0.05）。与模型组相比，参苓白术散高剂量组p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7、p-JNK/JNK、p-AP-1/AP-1 均 有 所 降 低（P＜0.05），参苓白术散中剂量组和美沙拉秦肠溶片对照组p-AP-1/AP-1 亦有所降低（P＜0.05）。与美沙拉秦肠溶片对照组相比，参苓白术散各剂量组p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7、p-JNK/JNK、p-AP-1/AP-1差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图6、图7。

图6 参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织中MKK4、MKK7、JNK、AP-1蛋白表达及磷酸化的影响Fig.6 Effect of Shenlingbaizhu Powder on MKK4，MKK7，JNK，AP-1 protein expressions and its phosphorylation in colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

图7 各组大鼠结肠组织MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白表达电泳图Fig.7 Electrophoresis diagram of expressions of MKK4，MKK7，JNK，AP-1 and their phosphorylated proteins in colon tissue

3 讨论

UC作为一种非特异性慢性炎症性肠病，发病机制尚未完全明确。UC 起病缓慢、病症轻重不一、病情反复，临床以反复腹泻、黏液脓血便、里急后重、腹痛等为主要表现［8］。湿热蕴肠为UC 活动期主要病因病机，而脾虚湿困则是导致UC 迁延反复的主要因素，为缓解期关键病因病机，其中脾虚为本、湿困为标，诚如张景岳云：“凡里急后重者……其病不在广肠而在脾肾也”“脾弱者，因虚所以易泻，因泻所以愈虚，盖关门不固，则气随泻去，气去则阳衰，阳衰则寒从中生，固不必外受风寒，始谓之寒也”，《杂病源流犀烛·泄泻源流》亦载：“湿盛则飧泄，乃独由于湿耳。不知风寒热虚，虽皆能为病，苟脾强无湿，四者均不得而干之，何自成泄”，皆强调了UC虽病位在肠，但脾胃虚弱乃根本原因。脾胃运化失职，津液不得转输，水谷亦不可运化，因而致体虚湿盛，治疗应标本兼顾。《医方考》言：“脾胃喜甘而恶秽，喜燥而恶湿，喜利而恶滞”，治以参苓白术散（《太平惠民和剂局方》），健脾益气、和胃渗湿。脾悦甘，用人参、甘草补益脾气，苡仁健脾渗湿，扁豆健脾和中，味之甘者也；土喜燥，用白术燥湿利水、茯苓渗湿利水，甘而微燥也；脾喜香，砂仁辛香而燥，用以开胃醒脾；心生脾，故用莲肉益心；土恶水，故以山药治肾，亦可补脾养胃；桔梗入肺经，宣肺利气，甘而微苦，甘则性缓，故为诸药之舟楫，苦则喜降，能通天气于地道，无否塞之忧也［9］。

本课题组前期研究表明，参苓白术散可有效改善模型大鼠的症状、体征、结肠病理改变、炎症因子和分子蛋白表达水平［10］。有研究表明，MKK/JNK 信号通路在炎症性肠病中发挥重要作用［11］。本研究采用环境与饮食因素干预复建脾虚湿困证型，结合TNBS 与乙醇复合物建立脾虚湿困型UC 大鼠模型。选取美沙拉秦作为阳性对照药物，临床上美沙拉秦是治疗UC 的主要药物，通过调节肠黏膜局部花生四烯酸代谢的多个环节，抑制前列腺素、白三烯合成，清除氧自由基，抑制免疫反应［12］。

UC发病的重要因素之一是免疫异常，肠黏膜损坏与炎症细胞因子的大量释放关系密切。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路参与炎症和应激反应，所有MAPK家族成员均被TXY基序中的苏氨酸和酪氨酸残基由单一的双特异性激酶MAPK 激酶（MKK）催化 激 活［13-14］。作 为MAPK 重 要 的 激 酶，MKK4 和MKK7 能够特异性激活JNK 表达，JNK 作为MAPK超家族的重要成员，通过Thr183、Tyr185 特定的磷酸化位点激活，从而参与多种细胞增殖、分化过程［15］。在TNBS诱导的大鼠UC模型中，MKK/JNK 通路中作为关键激活因子的MKK4调控下游关键因子表达，MKK4 作为JNK 和p38 的直接激活因子，参与细胞凋亡、炎症和肿瘤发生的调控［16］。有研究表明，通过抑制MKK、JNK 等相关因子表达可进一步抑制炎症发展［17］。本研究结果显示，经药物干预后，参苓白术散可修复结肠组织受损黏膜，减少炎症细胞浸润，改善免疫器官指数表达，调控MKK4、MKK7、JNK、激活子蛋白1（AP-1）基因及蛋白表达水平。作为细胞内信号传导的第三信使，AP-1 是MAPK 激酶级联反应的靶点，其通过调节基因表达来应对多种刺激，包括细胞因子、生长因子、压力、细菌和病毒感染，因此AP-1 控制了许多细胞进程，包括分化，增殖和凋亡等［18］；而作为重要免疫因子的IL-17 和IL-2 能通过中性粒细胞的聚集诱导炎症反应级联水平，并可通过多种途径调节免疫刺激和免疫抑制间的平衡，与炎症性肠病密切相关［19-23］。本研究结果表明，27.9 g/kg 参苓白术散能够降低模型大鼠结肠组织及血清中炎症因子IL-2 和IL-17 含量，抑制炎症因子异常表达。

综上所述，参苓白术散可能通过调控MKK/JNK通路关键分子表达，修复结肠组织受损黏膜，减少炎症细胞浸润，其在UC 等相关性疾病的治疗中具有一定的应用前景，但炎症因子的表达调控途径较多，中药复方作用机制复杂，其作用靶点仍需进一步探究。