微生物代谢调控策略研究进展①

吴 贺 贺春萍

（1 云南农业大学农学与生物技术学院 云南昆明 650201；2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口 571101）

微生物细胞工厂已被广泛应用于包括氨基酸［1-2］以及像维生素、生物碱［3-5］等多种代谢产物的大规模生产。与化学合成和直接提取法相比，微生物发酵具有产率较高、环境污染小或无污染、操作简单、不需要大量活体材料等独特优势，代谢工程是指利用多基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。

自20世纪90年代提出代谢工程概念［6-7］，历经多年发展，代谢工程技术已被成功应用于多种生物化工产品和医药制品生产，如谷氨酸棒杆菌生产 ω-羟基脂肪酸［8］，重组大肠杆菌合成生松素［9］。早期的代谢工程主要基于菌株自身代谢条件，通过对能产生含有目标产物的原始菌株进行筛选，挑出天然条件下合成效率最高的菌株进行后续优化，包括提升关键反应效率，限制或消除不利于产物合成的副反应进行，以便人工改造出最适于合成目标产物的工程菌［10-11］。实际操作过程中有些菌株经过改造后，不仅不能提高目的产物合成效率，连自身正常的生长发育都很难保证［12］，而发酵过程中内部环境的不断变化，同样也会影响到菌株的生长和产物表达，特别是次级代谢产物［13］。根据查阅前期相关文献，微生物发酵过程效率低下大致有以下原因：①中间代谢物的积累形成反馈抑制降低目的产物产率；②细胞生长和产物合成中能量和前体物质的竞争会紊乱微生物整体代谢过程；③产物生成过程中有毒、有害物质的大量积累毒害细胞；④产物生成受到有关限速酶的抑制。

实际生产过程中不仅要考虑菌株的正常生长，还要考虑产物的合成效率，因此，生物学家提出基于传统代谢工程与现代计算机模型预测相结合的新方案，如针对单一菌株的通路分析与基因改造，在此基础上发展共培养菌落策略以及基于计算机预测的新型蛋白质工程与生物元件（核糖体开关，转录因子，RNA调控）介导的动态调控策略。随着微生物代谢理论与代谢特性认识的不断深入，通过基因改造提升现有菌种的发酵性能，发掘新的调控元件，人工改造设计新酶，都可实现大规模代谢网络途径的修饰和构筑。

1 通路分析与遗传改造

生物体内生化反应大多依赖于酶的催化，由于代谢网络中限速反应的效率主要与酶活性有关，因此，筛选编码限速酶的关键基因位点并进行合适的修饰改造，以提高反应速率积累目的产物，这是传统代谢工程的基本思路，也是增加产物产量最常用的方法之一。具体方法是对菌株代谢通路进行分析，确定限速位点和限速酶，利用基因编辑修饰限速酶基因，或转入外源基因产出高活性目标酶类，提高限速反应速率，提升目标产物产率。另一种方法是通过CRISPR-Cas9基因敲除技术去除某些副反应相关基因，阻断与目标途径相竞争的代谢途径，使底物和能量向目标反应倾斜，提升目标产物产量。在实际生产中两种策略往往联用以期达到更好的效果。如张齐全等［14］以毕赤酵母GS115为出发菌株，对肌醇合成通路的关键基因IPS进行过表达并敲除两个合成转运蛋白的基因，解除毕赤酵母对肌醇合成途径的代谢调控；同时选择两个外源肌醇合成基因转入毕赤酵母过表达，结果显示重组菌株的肌醇产量为5.04g/L，与原始菌株相比，产量有明显提升。

2 菌株共培养调控策略

微生物代谢工程可以根据需求在单个菌株中通过构建和优化代谢途径来生产代谢产物，但单个菌株无法应对时，效率会下降。因此，提出了将负责不同代谢物合成途径的微生物聚类在一起形成菌群，以减少单个菌株代谢负担，提高效率的新策略——菌株共培养调控策略［15-17］（以下简称共培养调控策略）。共培养调控策略将完整的生物合成途径模块化，通过多种微生物各自负责某一特定模块井然有序地完成每一步反应（图1）。与传统的单菌株培养方法相比，共培养调控策略可以减少各菌株的代谢负担，能承受更剧烈的环境变化［18］。目前，该技术已应用于包括氨基酸、蛋白质、类黄酮、生物碱、萜类化合物等代谢产物的生产［19-20］，如 Jones J A 等［21］通过 4 种不同大肠杆菌菌株的混合培养来合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，将天竺葵素-3-O-葡萄糖苷合成途径拆分为4个模块。第一种菌株负责将葡萄糖、木糖和甘油转化为苯丙酸；第二菌株利用苯丙酸和外源添加的丙二酸生成黄烷酮；通过第三菌株负责将黄烷酮转化为黄烷醇；第四菌株过表达花青素合酶（ANS）和3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）基因分别将黄烷醇转化为花青素，并分别对花青素进行糖基化修饰。利用共培养调控策略合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，最高产量为9.5 mg/L，是单培养物的11.2倍。

图1 共培养菌群生产代谢产物示意图［22］

共培养调控策略虽已取得较大进展，但仍处于起步阶段，还需要进一步的优化。如共培养菌落策略如何确保共培养菌株中所有或绝大部分菌株都能在同一种生长条件下高效生长，并且菌株之间不会产生相互抑制的有毒化合物，这需要尽量选择同一种属菌株［23］。如应用共培养菌落策略当资源有限时，菌株之间就可能会产生竞争，最终破坏整个系统的稳态，可往培养体系不断添加新鲜培养液以维持大多数菌株最适生长条件。

3 新型蛋白质工程策略

酶的催化是大多代谢反应高效完成的一种不可或缺的要素，酶在代谢工程中通常是作为生物催化剂调节代谢途径的反应效率，前期代谢工程大多集中在通过增加基因表达水平和酶浓度来改变代谢通量，然而大多天然酶在工业条件下稳定性较差，催化活性低，存在反馈抑制等问题，极大阻碍了天然酶在工业生物技术中的应用。作为系统代谢工程和合成生物学的有力工具，新型蛋白质工程通过基于计算机协助的“定向进化”“理性设计”两种策略构建具有所需特性的新型酶或蛋白质［24］，提高关键酶在天然代谢途径中的活性和效率，现已成为微生物代谢改造中不可或缺的方法之一。

图2 定向进化（Directed evolution）和理性设计（Rational design） 流程示意图［24］

3.1 定向进化（Directed evolution）策略

定向进化已成为改善酶特性最有效的方法之一［25］，即通过构建突变文库，筛选改良变异库。此方法不需要了解蛋白质的结构信息［26］，近年来，对定向进化结果的筛选方法也有一定的研究，如Gul I等［27］用一种改造后的96孔板纸面高通量筛选法，在纸面上让酶和含目标底物的指示剂结合并反应，以指示剂单位时间内颜色强度变化度量酶活性大小。此方法快捷方便，也不需要昂贵的仪器和大量试剂，显示了纸基全细胞筛选与数字图像比色法相结合的潜力，是发现工业上重要酶极具前景的方法。

3.2 理性设计（Rational design）策略

与定向进化不同，理性设计是通过改变蛋白质结构来实现预期目标，该方法要求使用者对蛋白质的分子结构信息有一定了解。随着结晶学、结构生物学和生物信息学算法的发展，人们可以准确设计出具有所需特性的蛋白质［28-29］。Wang H等［30］利用了一种基于抑制结合态和二次设计的合理分子设计，该策略包括：①预测胃蛋白酶-BGL1复合物结构的相互作用点和关键氨基酸；②通过结构评估优化胃蛋白酶抗性突变体；③设计突变体的分子结构并构筑。

3.3 半理性设计（Semi-rational design）策略

半理性设计策略是定向进化和理性设计策略的有机结合，即先根据蛋白质知识合理选择用于突变的候选残基，构建小型随机突变文库，识别出具有所需特性的突变酶。该策略结合了两个策略的优点，能准确快速筛选所需要的突变酶，但要求研究者需要掌握一些与蛋白质结构和分子互作相关的知识，目前开始在酶改造中广泛采用。如Li P等［31］利用半理性设计策略联合计算机辅助分析提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS）活性，首先通过同源建模和分子对接锁定GlmS和底物6-磷酸果糖（F6P）的结合位点；其次，利用Py‐MOL软件分析GlmS三级结构和结合位点的拓扑结构；最后，选择5种氨基酸位点Leu593、Ala594、Lys595、Ser596和Val597为突变点构建突变文库，筛选结果表明当5种氨基酸位点之一的Leu593突变为Ser593时，酶活性从5 U/mL增加到48 U/mL，分子动力学模拟结果表明Ser增强了蛋白质的柔韧性，最终导致酶活性增加。可见，半理性设计策略在代谢工程的未来发展中具备相当大的潜力。

4 生物元件动态调控

4.1 动态调控策略概况

通路分析与遗传改造策略、菌株共培养调控策略和新型蛋白质工程策略等没有考虑菌株生长内部环境的变化，因此，把这些策略统称为静态调控策略。实际上微生物所处环境并不是静止的，环境的细微变化会影响微生物的生长和表达，因为工程菌株自身无法针对这种变化进行及时的调控。为此，Anesiadis N等［32］首先提出了动态代谢工程（Dynamic metabolic engineering）概念，其主要内容是启动子、核糖体结合位点（Ribosome binding site， RBS）、非编码RNA等监测调控元件根据胞内代谢物含量或外界环境动态变化精确调控某些基因，尤其是异源基因的表达。然而，在当时研究条件下，大部分调控组件因菌体自身或外部环境限制无法发挥作用，加之某些代谢途径的调控机制还未完全了解清楚，因此限制了该策略的发展。 近年来，经过生物学家的不断努力，许多调控元件已被用于多种代谢体系的动态调控策略，尤其是当常规策略不适用于目前状况时。如Zhang Q Q等［33］以毕赤酵母作为工程菌株生产肌醇时，为了控制细胞生长和肌醇产生之间的代谢通量分布，用甘油诱导启动子替代了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf），葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）和6-磷酸果糖激酶（Pfk1）基因的启动子，因此，突变菌株可以通过依次补充甘油和葡萄糖从生长模式切换到生产模式，导致肌醇产量增加至原来4.9倍。Wu J J等［34］以丙二酰辅酶A为底物利用大肠杆菌生产柚皮素时发现，利用常规代谢调控策略会产生明显负面效应，菌株生长迟缓并死亡，因此初步构建了一种依赖于反义RNA（asRNA）的微调途径平衡丙二酰辅酶A对细胞生长和产物合成的需求。通过asRNA系统可以逐步沉默2个脂肪酸合成反应关键基因fabB和fabE抑制脂肪酸合成，同时丙二酰辅酶A也随fabB和fabE沉默的增加而累积，使大肠杆菌从生长模式（脂肪酸合成）逐步过渡到生产模式（柚皮素合成），但进一步的基因沉默作用导致中间代谢物积累，抑制终产物生产。这说明相对于一般的静态调控，模拟自然调控的动态调控策略在平衡微生物生长与生产间具有较大优势，可能会成为微生物代谢工程的主要发展方向和研究热点之一。

4.2 动态调控策略存在的问题和挑战

动态调控策略能提高微生物发酵能力，但目前由于大部分调控元件作用未知，可能同一调控元件在不同菌株中产生的调控效果也不同，因此，目前动态调控策略只在少数已成功解析出代谢通路的工程菌株中得到有效应用，大规模应用于实际生产还有许多亟待解决的问题：①部分策略往往需要添加诱导物或改变培养条件，这有可能会和菌株原始生长条件相抵触，增大菌种突变率，导致调控系统不稳定［11］。②构建某些外来系统可能会破坏菌体稳态，影响其正常生长周期。③代谢途径的激活或抑制可能需要特定生物大分子的辅助作用，因此，动态调控策略还有待继续完善，相信日后动态调控策略的发展将会吸引更多研究者们的关注和参与。

5 展望

自然界中微生物分布极为广泛，前人研究已表明，微生物代谢调控机制与微生物自身特性息息相关。这对代谢工程的发展提出了更严峻的挑战。一方面许多工业微生物自身代谢途径复杂多样，需要将模块分析预测和系统代谢工程有机结合，不断调整优化策略保持菌株最佳代谢效率；另一方面大多微生物的代谢效率依赖于限速酶活性和底物结合能力，因此，进一步发展蛋白质工程，通过提高酶活和底物结合能力，可能会发现突破产物合成瓶颈的有效办法。

随着计算机领域中人工智能、云计算理念引入到包括代谢工程在内的诸多领域中，有力支持了微生物代谢通路的解析和预测，同时也标志着代谢工程开始向大型化、自动化、智能化发展［35］。而生物学领域CRISPR-Cas9基因编辑技术［36-37］、RNA干扰［37-38］等新型基因编辑工具的出现，给研究者们提供了更多选择来系统深入分析预测出的菌株代谢基因。而新调控机制和调控元件的不断出现，使得微生物细胞工厂构筑和代谢调控方法更加成熟稳定，这必然会为未来转入实际大规模生产提供更加丰富的理论依据和实践基础。