基于均匀设计法的粗品糖肽的提取工艺研究①

唐碧蓉 黄敬春 石星亨 唐赵强 曾艳红 陈丽欣 卓林娟 符文耀 王会娟 蒋淑荣

（1 广东蔚徕实验室科技发展有限公司 广东湛江 524000；2 广东科诚实验室装备有限公司 广东湛江 524000；3 农本科技（湛江）有限公司 广东湛江 524000）

糖肽是一类寡糖与多肽相结合的大分子化合物，糖肽在如糖肽类抗生素和抗肿瘤疫苗的糖类药物研发中有着十分重要的应用。糖肽合成难度较大［1-2］，国内多以灵芝、云芝、纳豆菌、人参等原料进行提取，成本较高［3-7］；国外多以猪胃黏膜或猪十二指肠为原料进行提取，成本相对低廉。广东省年出栏生猪3 300万头、年消费生猪5 000万头，是生猪生产和消费的大省，具备制造糖肽的物质基础。目前，国内因糖肽提取效率不高，多为进口，因此，有必要对硫酸糖肽生产工艺进行优化。本研究以猪十二指肠为原料，采用均匀设计法对提取温度、时间、pH值进行优化，以期改进国内糖肽提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

猪十二指肠；丙酮（莱阳经济技术开发区精细化工厂）；氢氧化钠溶液；醋酸溶液；氯化钠；胰蛋白酶。

1.2 方法

1.2.1 均匀实验设计

根据预试验，选定提取温度（X1）70～100 ℃、时间（X）210～40 min、pH值（X）3为8～10，以粗品产量为指标，运用王玉方“均匀设计3.00软件”，采用用U6*（64）均匀设计表设计实验。

1.2.2 糖肽提取

选取冰冻的猪十二指肠500 g绞碎成糜状，置于烧杯中，加入500 mL水，按表1方案进行碱解，然后用80%醋酸调节pH值至4.7左右，冷却。纱布过滤，向滤液加入0.5倍体积的丙酮，离心（3 000 r/min、15 min）；上清液中加入药液体积4倍量的丙酮，分级沉淀，沉淀物用丙酮脱水2次。50 ℃真空干燥，得到碱解后糖肽。将碱解后粗品溶于500 mL纯化水，加入15 g分析纯氯化钠，加入酶解后粗品质量1%的胰蛋白酶，45 ℃、pH值8.5条件下酶解5 h，过滤，滤液分级、脱水、干燥，得到粗品糖肽。

2 结果与分析

均匀设计试验结果如表1所示，应用“DPS9.50标准版”软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析。

表1 均匀设计试验结果

2.1 单因素影响分析

选用模型最大值为寻优类别，研究模型诊断（单因素影响）温度、提取时间、pH值对提取率的影响。由图1~3可以看出，随着提取温度的增加，提取率增加；随pH值的增大，糖肽提取率增加；随着提取时间的延长，提取率降低。当提取时间为34 min时，提取率最低，可能原因是随着提取时间的延长，糖肽降解为小分子物质。无法被非水溶剂沉淀；

图1 不同温度的提取率

图2 不同时间的提取率

图3 不同pH值的提取率

2.2 三因素综合影响分析

采用“DPS9.50标准版”软件进行线性回归，得到线性回归方程为Y=-3.411 7+0.017 3X1-0.008 0X2+0.316 1X3，其中相关系数R=0.929，F值=4.219 1，回归方程不显著。各因素影响强弱顺序为pH（X3）＞提取温度（X1）＞提取时间（X2），pH值为糖肽提取率的主要因素，提取时间和温度为次要因素。

以粗品糖肽提取率为因变量，各因素为自变量，采用DPS软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析，回归方程为Y=-1.299-0.005 08X2+0.000 827X2×X2-0.000 520X1×X2+0.003 320X1×X3。对方程进行显著性检验，复相关系数R=0.998，决定系数R^2=0.997，F值=81.07，p=0.083 1，说明回归方程有显著意义。综合提取实际情况，得出最佳提取工艺为温度（X1）100 ℃，时间（X2）10.8 min，pH 值 （X3） 10.46，将X1、X2、X3值代入回归方程，得出预测提取率为1.65%。

2.3 优选工艺条件验证试验

取冰冻的猪十二指肠500 g共3份，分别按优选的最佳提取工艺条件：温度100 ℃，时间10.8 min，pH值10.46进行提取酶解，称取糖肽粗品重量，并计算糖肽的提取率。试验结果显示，优化条件进行验证试验结果分别为1.52%、1.40%、1.56%，平均值为1.49%，与回归方程的预测值相近，说明此提取工艺稳定。国外相关技术提取条件为100 ℃、15 min、pH值9.2，其粗品糖肽的提取率为0.65%。本优化工艺糖肽的提取率比国外相关技术提取率高出100%。

2.4 糖肽检测

将本优化工艺获取的粗品糖肽经纯化、磺化、再纯化，与GENTIUM公司的硫酸糖肽样品对比。研究结果显示，本优化工艺所得粗品糖肽经处理后获得的硫酸糖肽中总硫含量为15.406%，属于较高水平，说明本优化工艺获得的粗品糖肽质量较高。

3 结论与讨论

通过优化从猪十二指肠中提取糖肽工艺，结果发现糖肽最佳提取工艺为提取温度为100 ℃，提取时间为10.8 min，pH值10.46。碱解和酶解是影响糖肽提取的关键步骤，碱解前所用冰冻猪十二指肠应尽量粉碎，颗粒度越小，越有利于糖肽的提取，同时需要保证各试验中原料粉碎度相同，尽量减少其他因素对糖肽提取影响；碱解时在温度未达到设定值前，将提取液调至中性，减少试验误差。碱解产物应尽量去除丙酮，否则会影响酶的活性。