3株丹参根际促生细菌的筛选、鉴定及作用评价

王 飞，李雪梦，杨 瑾，文 艺，赵晨晨，赵 莹，刘玉霞，高素霞，戚文平，秦艳红，鲁传涛

（1. 河南省农业科学院 植物保护研究所，河南 郑州 450002；2. 河南农业大学 植物保护学院，河南 郑州 450002）

丹参（Salvia miltiorrhiza）以根入药，可用于治疗心绞痛、冠心病等心脑血管疾病，是我国传统中医中应用最早、最广泛的药材之一[1]。在丹参栽培过程中，根腐病、枯萎病等发生危害严重，是造成产量损失和连作障碍的重要因素[2-4]。单一化学防治持效性差，并对环境和药材质量造成严重影响[5]，因此，生产中亟需开发新型生物防治制剂来控制根腐病的发生，以达到生产安全丹参药材的目的。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）具有促进植物生长和抵抗生物及非生物胁迫的功能，已被广泛用于提高作物产量和降低病害的发生[6]。合理利用丹参PGPR 菌的生防、促生作用，通过PGPR 菌的定殖来促进丹参健康生长，减少化肥农药的使用，将为丹参绿色安全栽培技术提供新的思路和策略。

目前，丹参PGPR 菌的筛选和应用取得了一定进展。DUAN 等[7]从丹参根系中分离出的内生细菌阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）B5 能分泌2 种代谢物，其对丹参的3种致病镰刀菌具有抑制作用。段佳丽等[8]从万余株放线菌中筛选出1 株多功能放线菌密旋链霉菌（Streptomyces pactum）Act12，可显著提高丹参产量及药材中丹参酮ⅡA、丹酚酸B 和丹参素的含量。周莹等[9]从丹参根际分离到的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）2-1 和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）9-2，对 丹 参 根 腐 病 菌（Fusarium solani）有较好的抑制作用。以上关于丹参PGPR 菌的研究中，未见同时具有根腐病防治效果和促生作用的菌株，关于丹参根腐病的防治，也仅限于对病原菌的室内抑菌测定研究。鉴于此，拟从野生健康丹参根际土进行根际细菌的分离，结合平板对峙和吲哚乙酸（IAA）分泌能力测定筛选高效PGPR 菌株，并通过盆栽试验对各菌株的作用进行评价，以期筛选出兼具丹参根腐病防治效果和促生作用的PGPR 菌株，为丹参生物菌剂的开发应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试病原菌为丹参根腐病菌层出镰刀菌（F.proliferatum），由河南省农业科学院植物保护研究所中药材病虫害研究室分离保存。

供试土壤为河南省嵩县车村镇野生健康丹参根际土壤。

1.2 根际细菌分离与纯化

采用稀释涂布平板法[10]，从丹参根际土壤中分离细菌。取土样1 g，置于装有9 mL无菌水的50 mL离心管中，28 ℃、200 r/min 振荡30 min。将土壤依次稀释成10-3、10-4、10-5悬浮液，吸取稀释液100 μL均匀涂布于准备好的KB 平板上，每个梯度重复3次。将平板置于28 ℃培养箱中培养2 d。挑取不同类型的菌落于KB 平板上纯化2～3 次，接种于KB培养液中，28 ℃、200 r/min 振荡培养24 h，菌液与50%甘油按照体积比1∶1 混合保存于冻存管中，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 根际促生细菌筛选

1.3.1 初筛 采用平板对峙法[11]筛选对丹参根腐病原菌具有拮抗作用的细菌。以生长5 d 的病原菌F.proliferatum为指示菌，于菌落边缘打取5 mm 直径的菌丝块，接种至PDA 平板中心位置，在菌落四周点接纯化好的细菌，共培养6 d 后观察细菌与病原菌的对峙结果，初筛出对病原菌具有抑制效果的细菌。

1.3.2 复筛 将病原菌F. proliferatum接种到PDA平板中央，牙签刮取生防细菌，在距离病菌2.5 cm处两侧各划1 条3 cm 长的直线，对照只接种病原菌，每处理3个重复，将接种病原菌和生防菌的平板置于28 ℃培养箱中培养6 d，测量病原菌的直径，计算抑菌率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5 mm）×100%。

1.4 胞外水解酶活性测定

参照REN 等[12]的方法，分别挑取根际促生细菌单个菌落，接种于脱脂奶粉培养基、β-1，3-葡聚糖酶检测培养基和羧甲基纤维素酶检测培养基上，分别对其蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶和纤维素酶等胞外水解酶活性进行检测。

1.5 IAA检测

参考PATTEN 等[13]的方法，将初筛得到的根际促生细菌的种子液（OD600=0.5）分别接入无L-色氨酸和添加L-色氨酸（2 mg/mL）的KB 培养液中，28 ℃、180 r/min 振荡培养5 d 后，测定发酵液中IAA的含量。

1.6 根际促生细菌鉴定

1.6.1 形态鉴定 将根际促生细菌划线于KB 平板上，28 ℃倒置培养2 d，观察菌株的菌落培养特征。

1.6.2 分子鉴定 采用CTAB 法[14]提取细菌的基因组DNA，利 用16S rRNA 基因通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTAG-3＇）和 1492R（5＇ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）对基因组DNA进行扩增，扩增产物测序后在NCBI 数据库中进行BLAST 比对。下载近似种同源序列后，基于邻接法应用MEGA 7.0 软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位，设Bootstrap值为1 000[15]。

1.7 根际促生细菌生理生化特性测定

参考《常见细菌系统鉴定手册》[16]对根际促生细菌菌株进行生理生化特性测定，包括产过氧化氢酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V-P 测定试验、丙二酸钠利用试验、碳源利用试验、解无机磷试验、解有机磷试验、固氮试验、产嗜铁素试验和产氢氰酸试验，每处理3次重复。

1.8 根际促生细菌盆栽试验

1.8.1 生防作用评价 将丹参种子消毒后在滤纸上萌发，移入含灭菌土的营养钵培养20 d，浇灌菌悬液（107～108cfu/mL），灌根量为5 mL，共灌根2 次，间隔时间为7 d，以分别接种同样体积无菌水和50%多菌灵可湿性粉剂1 000 倍液作为对照，即无菌水对照组（CK1）和50%多菌灵可湿性粉剂1 000 倍液对照组（CK2）。第2 次灌根3 d 后接种丹参根腐病菌F. proliferatum孢子悬浮液（1×106个/mL）5 mL。每处理3个重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养，60 d后统计病情指数并计算防治效果[17]。

防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。

1.8.2 促生作用评价 将丹参种子消毒后在滤纸上萌发，移入含灭菌土的营养钵培养20 d，浇灌发酵液（107～108cfu/mL），灌根量为5 mL，共灌根2 次，间隔时间为7 d，以分别接种同样体积无菌水和KB培养液作为对照，即无菌水对照组CK1）和KB 培养液对照组（CK2）。每处理4 个重复。培养60 d 后调查丹参生长指标，测量株高、根长、叶宽、叶长、分根数，并分别称量茎叶鲜质量和根鲜质量。

2 结果与分析

2.1 丹参PGPR细菌的初筛和复筛

从6 份根际土样中共分离纯化出了657 株细菌，以丹参根腐病菌F. proliferatum为指示菌，初筛出66 株具有拮抗作用的细菌。复筛结果（图1）表明，菌 株K03-4、Pp03-41 和Pp146 对 病 原 菌F.proliferatum有显著的拮抗作用，抑菌率分别为66.15%、61.03%、48.21%。

图1 3株PGPR细菌与丹参根腐病菌的平板对峙效果Fig.1 Plate confrontation effect of three PGPR strains against pathogenic F.proliferatum

2.2 丹参PGPR细菌的胞外水解酶活性测定

PGPR 菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 在脱脂奶粉培养基上均能够产生透明圈（图2A），表明3 株PGPR 菌株均能够分泌蛋白酶。菌株K03-4 和Pp03-41 能在β-1，3-葡聚糖酶检测培养基上（图2B）和羧甲基纤维素酶检测培养基上产生透明圈（图2C），透明圈大小随着时间的推移而增大，表明菌株K03-4 和Pp03-41 能够分泌β-1，3-葡聚糖酶和纤维素酶；而菌株Pp146不能在2种培养基上产生透明圈，说明其不具备分泌这2种酶的能力。

图2 3株丹参PGPR细菌的胞外水解酶活性检测结果Fig.2 Detection results of extracellular hydrolase activity of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.3 丹参PGPR细菌的IAA测定

从图3 可看出，菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146在无色氨酸添加的KB 培养液中培养5 d 后，IAA 的分泌量分别为5.05、15.57、18.51 μg/mL，菌株Pp03-41 与Pp146 分泌的IAA 量显著高于菌株K03-4；在有色氨酸添加的KB 培养液中，菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 的IAA 分 泌 量 分 别 为51.37、61.35、78.33 μg/mL，菌株Pp146 分泌的IAA 量显著高于K03-4 菌株。3 株PGPR 菌株在无色氨酸和有色氨酸的KB培养液中均能够分泌IAA，且在有色氨酸添加的培养液中IAA 的分泌量均高于无色氨酸添加的IAA分泌量，其中菌株Pp146分泌的IAA量最高。

图3 3株丹参PGPR细菌分泌IAA的能力Fig.3 Ability of three PGPR strains from S.miltiorrhiza to produce IAA

2.4 丹参PGPR细菌的鉴定结果

2.4.1 形态鉴定 KB培养基平板上培养3 d，K03-4菌落为乳白色，表面扁平湿润，圆形，菌落稍小；菌株Pp03-41 菌落为乳白色，表面有褶皱湿润，圆形，菌落大；菌株Pp146 菌落为乳白色，表面稍隆起干燥，圆形，菌落小（图4）。菌体杆状有芽孢。

图4 3株丹参PGPR细菌的菌落形态特征Fig.4 Colony morphology characteristics of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.4.2 分子鉴定 将菌株的16S rRNA 基因测序结果在NCBI 上进行BLAST 比对，K03-4 与多黏类芽孢杆菌［Paenibacillus polymyxa（CP017968.3）］同源相似率为99.74%；菌株Pp03-41 与多黏类芽孢杆菌［P. polymyxa（CP010268.1）］同源相似率为99.80%；菌株Pp146 与多黏类芽孢杆菌［P. polymyxa（CP042272.1）］同源相似率为98.81%。随后利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树，聚类结果（图5）显示，菌株K03-4 与P. polymyxa（CP017968.3）的遗传距离最近，置信度为89%；菌株Pp03-41 与P.polymyxa（CP010268.1）的遗传距离最近，置信度为86%；菌株Pp146 与P. polymyxa（CP042272.1）的遗传距离最近，置信度为91%。

图5 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

结合形态学和分子生物学鉴定结果，确定菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 均 为 多 黏 类 芽 孢 杆 菌（P.polymyxa）。

2.5 丹参PGPR细菌的生理生化特性测定结果

对3 株PGPR 菌株的生理生化指标测定结果显示，仅菌株K03-4 能够利用丙二酸钠；菌株K03-4和Pp03-41在有机磷和无机磷培养基上均能产生解磷圈，而菌株Pp146 仅在无机磷培养基上产生解磷圈；3株PGPR菌株均产过氧化氢酶，不产氢氰酸，明胶液化、淀粉水解、V-P 测定、葡萄糖利用、乳糖利用、甘露醇利用、解无机磷、固氮、产嗜铁素等表现一致，均为阳性；甲基红试验结果均为阴性（表1）。

表1 3株丹参PGPR细菌的生理生化特性情况Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.6 丹参PGPR细菌的盆栽试验效果评价

2.6.1 生防作用评价 接种丹参根腐病菌F.proliferatum60 d 后，无菌水对照组（CK1）的病情指数为67.20，其他各处理的病指均显著低于CK1（表2）。其中，PGPR 菌株K03-4 和Pp146 对根腐病的防治效果分别达到了83.46%、68.31%，均高于50%多菌灵可湿性粉剂1 000 倍液对照组（CK2，53.15%）的防治效果，PGPR 菌株Pp03-41 处理后也有接近50%的防治效果（49.02%）。

表2 3株PGPR细菌对丹参根腐病的防治效果Tab.2 Control effect of three PGPR strains on root rot of S.miltiorrhiza caused by F.proliferatum

2.6.2 促生作用评价 接种各PGPR 菌的发酵液60 d后，与无菌水对照组（CK1）比较，K03-4、Pp03-41和Pp146 处理组丹参的株高分别增加40.79%、43.86%、38.48%，茎叶鲜质量分别增加90.41%、109.36%、105.90%，分根数分别增加133.61%、118.06%、162.61%，根鲜质量分别增加74.23%、105.29%、125.87%（图6、表3）。与KB 培养液对照组（CK2）比较，K03-4、Pp03-41 和Pp146 处理组丹参的株高分别增加29.77%、32.60%、27.64%，茎叶鲜质量分别增加18.76%、30.57%、28.42%，分根数分别增加89.12%、76.53%、112.59%，根鲜质量分别增加88.82%、122.49%、144.78%。盆栽试验结果表明，PGPR 菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 均能极显著提高丹参植株的株高、叶长、叶宽、分根数、茎叶鲜质量和根鲜质量（表3）。根长方面，仅Pp146 处理后显著高于对照。其中，Pp146 处理组根长、叶长、叶宽、分根数、根鲜质量均为最高，Pp03-41处理组株高和茎叶鲜质量最高。

图6 3株PGPR细菌对丹参的促生效果Fig.6 Growth-promoting effect of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

表3 3株PGPR细菌对丹参的促生指标统计Tab.3 Statistics of growth-promoting parameters of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

续表3 3株PGPR细菌对丹参的促生指标统计Tab.3（Continued） Statistics of growth-promoting parameters of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

3 结论与讨论

近年来的研究表明，健康植物根部能够富集大量PGPR 菌，可促进植物营养吸收、生长发育和提高抗逆能力[18-23]，应用PGPR 菌促进植物健康生长，从而降低化学农药和肥料投入已成为重要的研究方向。CHIALVA 等[24]的研究表明，与生长在基质中的环境相比，原始土壤中的微生物能够诱导番茄产生系统抗性，进而提高番茄对土传病害的抗性。本研究从野生丹参根际土壤中获得66株拮抗菌，经复筛和IAA 含量测定，筛选出K03-4、Pp03-41 和Pp146共3 株兼具生防和促生作用的高效PGPR 菌株，经鉴定，其均为多黏类芽孢杆菌（P.polymyxa）。许乐等[25]从丹参根内分离出1 株多黏类芽孢杆菌P.polymyxaDS-R5，对丹参根腐病有61.4%的防效，但未评价其促生作用。

本研究结果表明，K03-4 对丹参根腐病菌有66.15%的最高抑菌率，并对根腐病有83.46%的盆栽防治效果，Pp146 的IAA 含量最高且促进丹参根长、分根数和根鲜质量增加最多，说明平板对峙试验和IAA 含量检测可作为筛选具有生防和根系促生作用PGPR 菌的方法。酶活性测定结果表明，K03-4 和Pp03-41 均可分泌蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶和纤维素酶，这些胞外水解酶是生防菌抑制多种植物病原真菌生长的重要物质[26-27]，因此，K03-4 和Pp03-41可能是定殖在根部后通过降解根腐病菌细胞壁而发挥了生防作用。Pp146在平板对峙试验中仅有48.21%的抑菌率，且不具备分泌β-1，3-葡聚糖酶和纤维素酶作用，但在盆栽试验中却有68.31%的防效，即Pp146 菌株对丹参根腐病的防治作用可能是通过与丹参的互作而使丹参产生了系统抗性。IAA 含量检测结果为Pp146＞Pp03-41＞K03-4，根长和根鲜质量测定结果也表现为Pp146＞Pp03-41＞K03-4，与已报到的IAA 具有促进作物根系生长的结论一致[13，28]。3 株PGPR 菌株能够产嗜铁素，并具有溶磷和固氮能力，推测3 个菌株的促长作用可能与其具有促进营养元素吸收的能力有关[29-30]。本研究获得的K03-4、Pp03-41 和Pp146 共3 个PGPR 菌株防病、促生效果显著，为丹参生物菌剂的开发利用提供了高效菌株。本研究未进行大田试验，也未检测丹参的药效成分，下一步的研究中还需继续开展相关工作，并对PGPR 菌的防病促生机制进行深入研究。