刺五加浸膏对手机辐射剥夺睡眠果蝇的影响*

卞宏生，岳骊郦，沙吾列西·木拉提别克，毛登烜，郭红丽，黄莉莉

(黑龙江中医药大学院药学院，哈尔滨 150040)

随着移动通信技术的进步，手机与我们的日常生活密不可分。手机在使用时会产生电磁波，一部分会被我们的身体吸收，从而形成手机辐射[1]。我国现行《电磁环境控制限制》(GB8702-2014)中对公众照射限值进行规定，其中手机频段限值是0.4 W·(m2)-1[1]。通过对大量文献进行研究，发现手机辐射对神经系统[2-6]、内分泌系统[7-10]、生殖系统[11-12]有不同程度的损害，尤其影响人类睡眠，且存在性别差异和年龄差异[13-15]。

睡眠是一种适应个人需要并受到许多外部和内部刺激影响的行为。除了具有适应性行为外，睡眠还可以在神经元之间的突触连接水平上调节大脑的可塑性，而神经元的可塑性会影响睡眠[16]。对于睡眠研究的模式生物由线虫到斑马鱼逐渐发展到大鼠[17]，近年来因为果蝇与哺乳动物具有很多相同的重要特征而作为睡眠研究的新宠[18]。

近年来将果蝇用于辐射研究涉及基因、细胞。2020年AYA等[19]研究2.45 GHz微波对果蝇的生理和行为影响，检测到与微波辐射有关的遗传毒性和行为变化，归因于波的非热效应，并且观察到存在性别差异。PARK等[20]将果蝇照射后表皮为模型用于生物监测，定量分析细胞形态。李志辉等[21]通过建立手机辐射剥夺果蝇睡眠模型，实时连续监测果蝇在光照、RF[1 800 MHz，1 W·(m2)-1，12 h·d-1]及黑暗条件下的行为变化，对比分析各条件下果蝇运动和睡眠的异同。

刺五加具有益气健脾、补肾安神的功效，能够治疗失眠、多梦、健忘症等。现代研究发现刺五加对睡眠节律有调节作用，在治疗失眠、神经衰弱等方面有显著疗效。研究发现刺五加中有多种成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠时间和深度的功效[22]。刺五加对睡眠节律有调节作用，可减少24 h持续黑暗环境下果蝇的片段化睡眠[23]。芮施等[24]以小鼠为模式生物研究发现，刺五加镇静催眠作用机制为上调脑组织中5-羟色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)水平。刺五加可用于辐射研究，基于Nrf2-ARE通路对复方四物汤加味方中抗辐射的有效活性成分进行筛选，发现金丝桃苷具有很好的活性作用[25]。以上研究为本实验探究刺五加浸膏对手机辐射剥夺果蝇睡眠的干预作用提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1实验动物 野生型Canton S品系黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，由北京大学生命科学学院提供。

1.2实验试剂与仪器 蔗糖(分析纯，天津市化学试剂一厂，批号：20090410)；琼脂(细菌学级，产地日本，批号：20090328)；丙酸 (分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号：20091008)；酵母粉(食品级，安琪酵母股份有限公司，批号：20181221)；玉米粉(食品级)；刺五加浸膏(刺五加苷B含量为0.546%，刺五加苷E含量为0.328%，由黑龙江中医药大学中药药理教研室提供)；二氧化碳(CO2)麻醉装置(自制)；果蝇雌雄分离装置(自制)；果蝇活动监测系统(drosophila activity monitor system，DAMS)(版本v3.03，Trikinetics Inc.Waltham，MA，USA)。

1.3实验环境 空白对照组：采用自动定时光控系统对果蝇生活环境实行每天12 h ：12 h明暗光照周期处理，光照强度为400 lx，温度(24±1) ℃，相对湿度50%～60%。模型对照组和给药组：根据实验室前期预实验结果，对果蝇生活环境实行手机辐射干预，辐射量：30～190 μW·(cm2)-1，干预点：20：00—22：00，每30 min拨打电话10 min。注意在睡眠剥夺造模时，手机静音、息屏，且排除光刺激及声音刺激等影响，单纯为磁场辐射干预。其余条件同空白对照组。

1.4实验分组 以7日龄野生型Canton S品系黑腹果蝇作为观察对象。收集8 h内羽化未交配的果蝇，CO2轻微麻醉后区分雌、雄，随机分为空白对照组、模型对照组，低、中、高浓度给药组，每组32只。将新生果蝇置于相应环境中饲养，待用。

1.5实验方法

1.5.1果蝇培养基的制备 ①基础培养基制备。将玉米粉42 g与三级水160 mL充分搅拌混匀，配成A溶液备用。将蔗糖31 g、琼脂3 g和三级水300 mL充分搅拌、混匀，加热煮沸至琼脂完全融化，将上述A溶液缓慢加入，并不断搅拌，煮沸至糊状后停止加热。待温度降至约70 ℃，加入酵母粉3 g，充分搅拌，接着加入丙酸3 mL，并快速搅拌均匀，趁热立即分装于洁净的培养基管中(培养基若不慎附于管壁上，应舍去重新分装)，厚度约2 cm，待培养基完全凝固后，将培养管倒置于操作室内，静置24 h后方可使用。②含药培养基配制。准确称取不同质量的刺五加浸膏，见表1，同法进行制备，浸膏与酵母粉同时加入，充分搅拌使其均匀分散。

表1 不同浓度含药培养基的配方Tab.1 Formulation of medicated medium with different concentrations

1.6果蝇饲养及监测 ①空白对照组：果蝇给予基础培养基饲养5 d，于第6天移入监测管中，适应12 h。

轻微麻醉，用毛笔逐个装入细小玻璃管(内径5 mm，长65 mm，一端内装入基础培养基后用黑色小帽密封，另一端用棉球封住)。采用DAMS，在12 h ：12 h光照-黑暗交替条件下监测果蝇早7 ：00至次日早7 ：00的睡眠。DAMS数据采集软件每隔5 min自动记录一次活动次数。若持续5 min以上活动次数记录为零，即果蝇静止时间持续>5 min时，就认为果蝇处于睡眠状态，其他时间为果蝇处于觉醒时间[15]。②模型对照组：将手机置于监测仪旁，以辐射量30～190 μW·(cm2)-1，20：00—22：00，每30 min拨打电话10 min(将手机置于距监测仪1 cm处，使用电磁场辐射监测仪对手机辐射进行测量，确保辐射量在稳定范围内)对果蝇进行干预，其余条件同空白对照组。③给药组：果蝇给予含药培养基。小管一端内装入的是含药培养基。其余条件同模型对照组。

2 结果

2.1刺五加干预对果蝇睡眠-觉醒节律的影响 结果见图1和图2。通过图1分析可知，空白对照组雄果蝇白天(7：00—19：00)和夜晚(19：00—7：00)较多处于睡眠状态。与空白对照组比较，模型对照组果蝇白天(7：00—19：00)集中处于睡眠状态，夜晚(20：00—22：00，图中红色框区域，蓝框为空白对照组对照区域)期间因进行手机辐射干预，果蝇睡眠、觉醒出现交替性变化现象(片段化睡眠)，在干预结束后(22：10—7：00)，果蝇又恢复睡眠状态，这一现象表明手机辐射对果蝇睡眠具有负性影响作用。与模型对照组比较，3个给药组果蝇在辐射干预期间片段化睡眠减少，睡眠时长呈增长状态，其中低浓度给药组的睡眠-觉醒节律变化最为明显，同时与空白对照组的节律分布也最为接近。图2结果显示，空白对照组雌果蝇白天(7：00—19：00)集中处于觉醒状态，夜晚(19：00—7：00)集中处于睡眠状态。与空白对照组比较，模型对照组果蝇，白天(7：00—19：00)集中处于觉醒状态，夜晚(20：00—22：00，图中红色框区域，蓝框为空白对照组对照区域)期间因进行手机辐射干预，果蝇睡眠、觉醒出现交替性变化现象(片段化睡眠)，在干预结束后(22：10—7：00)，果蝇又恢复睡眠状态，这一现象表明手机辐射对果蝇睡眠具有负性影响作用。与模型对照组比较，给药组果蝇在辐射干预期间片段化睡眠减少，睡眠时长呈增长状态，其中高浓度给药组睡眠-觉醒节律变化最为明显，同时与空白对照组的节律分布也最为接近。

白色部分表示活动，黑色部分表示睡眠。图1 刺五加干预后雄果蝇的睡眠-觉醒节律图The white is activity, the black is sleep.Fig.1 Sleep wake rhythm of male Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention after Acanthopanax senticosus intervention

白色部分表示活动，黑色部分表示睡眠。图2 刺五加干预后雌果蝇的睡眠-觉醒节律图The white is activity, the black is sleep.Fig.2 Sleep wake rhythm of female Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention

2.2刺五加对手机辐射后的果蝇睡眠时间变化的影响研究 结果见表2。通过表2分析可知，与空白对照组比较，模型对照组雄、雌果蝇夜晚12 h内睡眠时间减少，差异有统计学意义(P<0.01)，表明造模成功。与模型对照组比较，雄性低浓度给药组白天、夜晚、全天睡眠时间明显延长，均差异有统计学意义(P<0.01)，高浓度给药组白天、全天睡眠时间明显延长，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组比较，雌性中浓度给药组白天睡眠时间明显缩短，高浓度给药组夜晚睡眠时间明显延长，均差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 刺五加干预对雄雌果蝇平均睡眠时间的影响Tab.2 Effect of Acanthopanax senticosus intervention on average sleep time of male and female Drosophila melanogaster

3 讨论

本课题组自2014年起，结合实验室前期研究基础，一直进行黑龙江道地药材刺五加与睡眠-觉醒节律的研究。先后利用果蝇模式生物，发现刺五加具有增加果蝇连续活动时间，减少片段化睡眠，影响睡眠节律的作用[23]；其主要成分刺五加总苷和刺五加苷B对果蝇睡眠时间、睡眠-觉醒节律和睡眠时间百分比的影响特征[27]。通过上述实验结果，课题组初步得出“刺五加可能通过调节生物节律来改善果蝇的睡眠”。

生物钟是调节大多数生物的许多行为和生理参数的先天计时机制。在现代生活中，高频率使用手机对生物产生了巨大的压力，因为电磁辐射通常会对包括生物节律在内的生物系统造成不同程度的损害。研究表明持续暴露于低强度微波辐射可能会通过改变昼夜节律系统和DNA损伤速率对大脑功能产生不利影响[28]。不仅果蝇长时间暴露于手机信号电磁辐射可能会引起运动障碍[29]，而且生物体许多其他行为变量也会在暴露于射频电磁场后发生变化[30-31]。手机辐射在一定程度上影响生物体的睡眠，而睡眠会影响整个动物界的神经行为表现。因此，为了进一步验证这一假说，课题组通过查阅文献并结合当前人们普遍实际，在前期实验基础上，探讨刺五加对手机辐射下的果蝇睡眠时长及节律特征。

果蝇睡眠-觉醒图的应用是研究果蝇睡眠节律的主要分析方法[32]，也是本研究的特色和难点。动物的节律研究往往存在数据量庞大、不易统计分析、难以发现数据规律等问题。为了解决这些问题，课题组结合国外研究方法，并通过前期研究从硬件参数的精确设置和软件自主编程两个方面进行优化，构成本实验的特色技术。从而解决果蝇睡眠监测的大数据的分析问题，保障本项目的顺利实施。①在硬件方面。DAMS是支持项目顺利实施的关键仪器之一。该仪器是在不损伤果蝇的前提下，通过果蝇撞击红外光束IR，判断果蝇活动次数。DAMS系统数据采集软件每隔5 min自动记录一次活动次数。每天累计采集288个数据。若持续>5 min活动次数记录为零，即果蝇静止时间持续>5 min时，就认为果蝇处于睡眠状态。②在软件方法。应用Visual Basic语言编程绘制睡眠-觉醒节律图，是支持项目顺利实施的第二个关键技术。该节律图是通过将果蝇活动数值数字化得到的，在区分活动数值0或非0的基础上绘制每一个点，提供一个确定睡眠-觉醒相位的简易方法。其统计方法具有效率高、误差小、不易出错等优点，对睡眠-觉醒节律的深入研究具有一定的参考价值，方便进行大数据的整体定性分析。

基于此，本研究初步从果蝇睡眠-觉醒节律和睡眠时间，定性和定量两个方面分析刺五加干预后果蝇在手机辐射下的睡眠情况。定性的节律图分析，可以从整体上了解果蝇睡眠-觉醒的大致分布情况，便于发现差异性规律，而定量的睡眠时间分析，可以找到这种差异性规律的统计学意义。

通过果蝇睡眠-觉醒图和平均睡眠时间的定性定量分析发现：刺五加浸膏对手机辐射条件下果蝇的睡眠时间和睡眠-觉醒节律的负性影响具有正向干预作用，但雌雄果蝇的特征不同，其最佳剂量也不同。这可能是果蝇的性别差异决定的[24，33]。 刺五加通过减少辐射干预期间果蝇的片段化睡眠，增加睡眠时长，改善果蝇的睡眠-觉醒节律状态。雄果蝇2%给药剂量白天、夜晚、全天睡眠时间明显延长，其睡眠-觉醒节律变化最为明显，与空白对照组节律分布也最为接近；雌果蝇8%给药剂量夜晚睡眠时间明显延长，其睡眠-觉醒节律变化最为明显，与空白对照组的节律分布也最为接近。此外，手机辐射对雌雄果蝇的干预表现基本相同。表现为：雌雄果蝇夜晚手机辐射干预期间(20：00—22：00)，果蝇睡眠、觉醒出现交替性变化现象(片段化睡眠)，在干预结束后(22：10—7：00)，果蝇又恢复睡眠状态，这一现象表明手机辐射对果蝇睡眠具有负性影响作用。这一现象与文献[34]报道基本一致。

通过实验结果分析发现，雌雄果蝇的睡眠-觉醒特征和对刺五加干预的反映均不同。因此，在研究中应该考虑果蝇性别的差异性。作为一种模式生物，雌果蝇白天较多处于觉醒状态，夜晚较多处于睡眠状态的节律分布规律，与人类的行为更加吻合。因此，在手机辐射对果蝇干预作用基本相同的基础上，笔者认为选择雌果蝇作为此类研究的模式生物，人们对果蝇睡眠行为和药物干预研究更便捷。另外，尽管4%给药剂量雌果蝇的白天睡眠时间呈缩短趋势，但从节律图分析，其睡眠-觉醒节律的分布与其他组白天较多处于觉醒状态，夜晚较多处于睡眠状态的基本规律吻合，其进行手机辐射剥夺研究，更重要的是观察夜晚手机辐射干预期间(20：00—22：00)的睡眠时间和节律变化，因此，其白天睡眠时间缩短的趋势，不影响整体节律的分析。

此外，本研究有一定的局限性，首先，果蝇的节律也会受到自然、人为的环境影响。本研究在黑龙江省冬季进行，这个地区较其他地区更为寒冷，未来可以在一些气候温暖的地区实验，来观察结果是否有所不同。其次，在实验中使用手机辐射，未来的研究应该采用其他种类的辐射，如电脑屏幕、WIFI、电磁炉、微波炉、信号基站、高压变压器等。第三，使用果蝇的数量较少，在以后的实验中，可以采用大数据来观察结果的重复性及有效性。第四，刺五加的不同功效与刺五加中不同成分密切相关，而此实验中并没有分开其成分进行探究，接下来会对其成分探索看其相关性。第五，本实验的对象种类单一，后期实验可以进行多物种实验，从而增加其普遍性。