基于“气血两清”理论探讨浮萍-紫草对银屑病模型小鼠皮肤屏障功能的影响

袁佳晴， 朱新景， 王星星， 郑琳琳， 景慧玲

（1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046；2.西安市中医医院，陕西西安 710021）

银屑病（psoriasis）是一种由免疫介导的慢性炎症性皮肤病，主要表现为红斑、浸润、鳞屑，累及人群较广[1-2]。有研究证实，银屑病与关节炎、心血管炎有相关性，危害较大[3]，临床上西医常规治疗效果不甚理想，复发率高，严重影响了患者的身心健康[4]。而中医药治疗该病具有一定的优势。浮萍-紫草是疏风清热凉血中药药对，临床常用于该病的治疗。本课题组前期已发现紫草的药效成分紫草素可通过Hippo-Yap信号通路在银屑病的早期发挥作用[5]。因此，本研究通过动物实验，基于“气血两清”理论进一步探讨“浮萍-紫草”对银屑病模型小鼠皮肤屏障功能的影响，以期为其临床推广应用提供基础。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级6～8周龄Balb/c小鼠120只，体质量（18±2）g，雌雄各半，购于第四军医大学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（陕）2018-001。饲养于西安医学院第二附属医院实验室，室温22～25℃，相对湿度40%～60%，自由饮水进食。适应1周后进行实验。

1.2 药物、试剂与仪器木犀草素（标准品，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司提供，批号：B20888）；紫草素（标准品，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司提供，批号：B21682）；阿维A胶囊（重庆华邦制药有限公司产品，批号：H20010126）；咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限公司，批号：H20030128）。10%甲醛溶液（太原市卫星制药有限公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。GPSkin Barrier检测仪（北京安德普泰医疗科技有限公司）；CX31型显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

1.3 分组、造模与给药将120只小鼠随机分为12组，即空白组，模型组，阳性对照组，浮萍低、中、高浓度组，紫草低、中、高浓度组，浮萍-紫草低、中、高浓度组，每组10只。

造模方法[6-7]：造模前1 d，除空白组外，其他各组小鼠脊背两侧均进行脱毛处理，面积约为3 cm×3 cm。次日10∶00，在脱毛区域外涂5%咪喹莫特乳膏42 mg，1次/d，连续7 d。空白组仅做脱毛处理。

给药与造模同时进行。各组小鼠于每日16∶00给药：空白组、模型组灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃阿维A的蒸馏水混悬液；浮萍低、中、高浓度组分别灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素标准品的蒸馏水混悬液；紫草低、中、高浓度组分别灌胃20、40、80 mg/kg紫草素标准品的蒸馏水混悬液；浮萍-紫草低、中、高浓度组分别灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素与紫草素标准品混悬液[8]。1次/d，连续7 d。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 银屑病面积及严重指数（PASI）评分 采用PASI评分标准[9]，对皮肤症状从红斑、浸润、鳞屑3项指标进行评价，以0～4分进行记分：无症状，计0分；轻度，计1分；中度，计2分；重度，计3分；极重度，计4分。将各指标积分相加得到总积分。

1.4.2 皮肤组织病理学观察 造模与给药结束后，颈椎脱臼处死各组小鼠，剪取背部皮损处组织，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，进行HE染色，光镜下观察皮损组织的病理表现。

1.4.3 皮肤屏障功能检测 分别于干预的第1、3、7天，采用GPSkin Barrier检测仪测量小鼠经表皮水分丢失（TEWL）、角质层含水量（SCH）、皮肤湿度。

1.5 统计方法采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤银屑病面积及严重指数（PASI）比较图1结果显示：干预第7天，与模型组比较，各治疗组PASI评分均有所降低，且与阳性对照组比较，浮萍高浓度组、紫草各浓度组、浮萍-紫草各浓度组改善更明显（P＜0.05）。浮萍高浓度组、紫草高浓度组、浮萍-紫草高浓度组PASI评分于干预第7天低于相应中、低浓度组（P＜0.05）。可见浮萍、紫草、浮萍-紫草高浓度效果明显，且浮萍-紫草组效果优于浮萍组、紫草组。

图1 各组小鼠皮肤银屑病面积及严重指数（PASI）评分变化Figure 1 Comparison of changes of PASIscore of mice in various groups

图2 结果显示：干预第7天，空白组无变化，其他各组都出现不同程度的红斑、浸润、鳞屑。与模型组比较，各治疗组的红斑、浸润、鳞屑都相对减轻。与阳性对照组比较，中、高浓度的浮萍组、紫草组、浮萍-紫草组的红斑、浸润、鳞屑均有不同程度的减轻。在浮萍组中，高浓度组的皮损较低、中浓度组减轻；在紫草组中，高浓度组的皮损较低、中浓度组减轻；在浮萍-紫草组中，高浓度组的皮损较低、中浓度组减轻。各中药组的比较中，浮萍-紫草组皮损改善情况最优、效果更明显。

图2 各组小鼠干预第7天皮肤外观差异比较Figure 2 Comparison of mouse skin appearance of various groups on day 7 of intervention

2.2 各组小鼠皮肤组织病理表现比较图3结果显示：空白组小鼠皮肤组织结构清楚，层次分明，表皮厚度正常；模型组小鼠可见皮损类银屑病样，表现为表皮明显增厚，伴角化不全，棘层增厚，颗粒层明显减少，表皮突延长，真皮层可见乳头水肿、血管扩张，伴见炎性细胞浸润；与模型组比较，各给药组小鼠皮损处表皮可见不同程度变薄，角化不全明显减少，炎性细胞浸润也减少，其中，浮萍-紫草高浓度组改善程度最为明显，其次为紫草高浓度组和浮萍高浓度组。

图3 各组小鼠皮肤组织病理表现比较（HE染色法，×400）Figure 3 Comparison of changes of mouse skin lesions in various groups（by HE staining，×400）

2.3 各组小鼠不同时间经表皮水分流失（TEWL）比较表1结果显示：干预第1天，各组TEWL比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠不同时间经表皮水分流失（TEWL）比较Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

表1 各组小鼠不同时间经表皮水分流失（TEWL）比较Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较；⑤P＜0.05，与阳性对照组比较

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干预第4天，与空白组比较，模型组TEWL升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），而阳性对照组、浮萍中浓度组、紫草中浓度组TEWL降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组TEWL均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

干预第7天，与空白组比较，模型组TEWL升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），而各给药组TEWL均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TEWL均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），其中，浮萍-紫草高浓度组TEWL明显低于阳性对照组（P＜0.05）。

2.4 各组小鼠不同时间角质层含水量（SCH）比较表2结果显示：干预第1天，与空白组比较，浮萍高浓度组SCH升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠不同时间角质层含水量（SCH）比较Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

表2 各组小鼠不同时间角质层含水量（SCH）比较Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，与阳性对照组比较

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干预第4天，各组小鼠SCH较干预第1天均有所下降。与空白组比较，模型组，浮萍高浓度组，紫草中、高浓度组，浮萍-紫草中、高浓度组小鼠SCH降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组，浮萍高浓度组，紫草低、中、高浓度组，浮萍-紫草中、高浓度组SCH升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且浮萍低浓度组，浮萍-紫草低、中、高浓度组SCH高于阳性对照组（P＜0.05或P＜0.01）。

干预第7天，除模型组外，其余各组SCH含量较第4天均有所升高。与空白组比较，模型组，紫草低、高浓度组SCH升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组，浮萍高浓度组，紫草高浓度组，浮萍-紫草中、高浓度组SCH升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，紫草低、中浓度组，浮萍-紫草低浓度组SCH升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 各组小鼠不同时间皮肤湿度比较表3结果显示：干预第1天，各组皮肤湿度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组小鼠不同时间皮肤湿度比较Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

表3 各组小鼠不同时间皮肤湿度比较Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较

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干预第4天，各组皮肤湿度较干预第1天均有所降低。与空白组比较，模型组，浮萍中浓度组，紫草低、中浓度组，浮萍-紫草低、中浓度组皮肤湿度皮肤湿度降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组，浮萍低、中、高浓度组，紫草低、高浓度组，浮萍-紫草高浓度组升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；各治疗组间皮肤湿度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

干预第7天，除模型组外，其余各组皮肤湿度较干预第4天均有所升高。与模型组比较，浮萍-紫草低、高浓度组皮肤湿度升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

银屑病在中医学中称为“白疕”，多由于素体血中蕴热，复感风热毒邪，或恣食腥发动风之物，或情志内伤，五志化火，两阳相合，内不能疏泄，燔灼血液，充斥肌肤，发为白疕[10]。因此，中医辨证治疗银屑病的主要治法是清热凉血解毒、祛风散邪止痒。在临床治疗中，气血两清是较为常用的方法，浮萍紫草药对出自名老中医施今墨[11]，二者可气血双清，透疹解毒，祛风止痒。药对浮萍-紫草中：浮萍味辛，性寒，入肺经达皮肤，体轻气浮，偏走气分，升散力强；紫草味甘，性寒，色紫质滑，入心、肝经，专入血分，长于清血分热毒。浮萍-紫草二药伍用，一气一血，气血两清，透疹解毒，祛风止痒[11]。

现代医学中，紫草抗银屑病作用主要因其主要成分紫草素可抑制表皮角质形成细胞增殖、抑制炎症反应、抑制血管增生[12-13]。本课题组前期在“从血论治”的理论指导下，对紫草的抗银屑病作用机制进行了研究[14]。浮萍的主要成分是木犀草素、芹菜素[15]，查阅文献发现浮萍能够抗氧化、抗衰老、止痒[16-17]，其主要成分木犀草素可抗氧化、抗炎[18]、降低VEGF的表达，抗黑素瘤[19]。为有效地验证浮萍与紫草的现代药理研究及其药对对银屑病的治疗作用机制，故选择浮萍、紫草的主要活性成分作为研究对象，观察其对银屑病皮损区的皮肤屏障修复作用机制，也为后期的细胞实验奠定了一定的基础。本研究的直接指标皮损结果显示：模型组存在表皮增厚、棘层增厚、颗粒层减少、炎性细胞减少等银屑病样的皮损，而浮萍-紫草药对能使银屑病皮肤表皮不同程度变薄，角化不全明显减轻，炎性细胞浸润也减少，表明浮萍-紫草药对可改善银屑病小鼠的皮损。

本研究于干预第1、4、7天时，计算PASI评分并检测TEWL、SCH、皮肤湿度，探讨浮萍-紫草药对对银屑病小鼠皮肤屏障功能的影响。PASI结果显示：干预第7天，除模型组外，与阳性对照组比较，浮萍组、紫草组、浮萍-紫草组的PASI评分均降低，表明浮萍组、紫草组、浮萍紫草组对皮损改善作用优于阳性对照组。且在浮萍组、紫草组、浮萍-紫草组中，浮萍、紫草联用治疗效果优于单药使用。

有研究证实，银屑病皮肤屏障功能缺损[20]。本研究结果显示：模型组TEWL显著升高，SCH明显降低，表明银屑病存在皮肤屏障功能的缺损。而使用浮萍-紫草药对可以不同程度地改善银屑病受损皮肤屏障功能，提示浮萍-紫草药对可减少皮肤SCH，增加角质层的含水量，提高表皮湿度，从而修复屏障。

综上所述，改善皮肤屏障功能是预防治疗银屑病的关键步骤。本研究通过动物实验也证实了中药浮萍、紫草分别或联合均能改善小鼠银屑病模型的皮损，对银屑病的皮肤屏障功能有修复作用，且药对联合改善作用更加显著，体现了“气血两清”。这对于今后银屑病的诊治有一定的指导意义。后期将以皮肤屏障等相关因子、免疫相关因子为切入点进一步探讨浮萍-紫草治疗银屑病的相关机制，以为其今后的临床工作提供基础理论支持。