血必净对大鼠睾丸扭转/复位缺血再灌注损伤的修复作用

施源， 李宏军， 王君君， 李坚， 邓新超， 鲁密， 张辉

（武汉市第八医院，湖北武汉 430010）

睾丸扭转是泌尿外科常见的急症，也是男性生殖器损伤的原因之一，其表现为睾丸连同周围的附睾以及精索发生扭转。睾丸扭转，精索内血流不畅和睾丸缺血，引起睾丸生殖细胞凋亡坏死，可致患者生殖能力受损或缺失[1-2]。一经确诊为睾丸扭转，临床上需尽早通过手术方式进行睾丸扭转复位，恢复睾丸血液流动，减轻睾丸损伤[3-4]。但睾丸扭转复位是缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的病理生理过程，仍可促使睾丸生殖细胞凋亡增多，导致睾丸萎缩和精子生发功能障碍[1，4-5]，目前尚无理想的防治方法。血必净注射液（以下简称“血必净”）是一种中药复方制剂，具有抗氧化、抗炎、改善组织微环境、减轻组织细胞损伤等多种功效[6-7]。有研究报道，血必净对I/R损伤具有一定的改善作用[7-9]；但血必净对睾丸扭转复位引起的I/R损伤的治疗作用及机制尚不清楚。因此，本研究探讨血必净对大鼠睾丸I/R损伤的修复作用，以期为临床治疗睾丸扭转/复位，减轻睾丸I/R损伤提供一定的理论参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自湖北省疾控中心，动物质量合格证号：2000600023890。动物实验于武汉华联科生物技术有限公司动物研究中心进行，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0014。SD大鼠于SPF级条件下饲养，饲养温度为22～26℃，相对湿度为50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 药物、试剂与仪器血必净注射液（天津红日药业股份有限公司生产，批号：国药准字Z20040033）；地塞米松（美国Sigma公司生产，货号：D4902）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和Toll样受体4（TLR4）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（美国Bioswamp公司）；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。DM1000正置显微镜、RM2235石蜡切片机（德国徕卡显微系统有限公司）；TB-718D石蜡包埋机（湖北泰维科技实业有限公司）；AMR-100酶标分析仪、iCEN-24R离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 分组、动物模型建立与给药将40只大鼠随机分为5组，即假手术组，模型组，血必净低、高剂量组和地塞米松组，每组8只。所有SD大鼠经适应性饲养1周后进行正式实验。除假手术组外，其他4组大鼠均采用Turner法[10]构建睾丸扭转大鼠模型。造模方法：采用30 g/L戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，大鼠取仰卧位，固定四肢及头部，采用常规备皮、酒精消毒，取左侧阴囊切口约3 cm，逐层切开皮肤、皮下组织及肉膜，将左侧睾丸从切口挤出，游离左侧睾丸，分离筋膜至附睾，结扎并切断睾丸引带，顺时针扭转睾丸720°，维持2 h后复位并于阴囊壁固定，关闭切口。睾丸由暗红色变为鲜红色则表明造模成功[11]。给药方法：睾丸扭转手术后，血必净低、高剂量组大鼠分别对应给予腹腔注射血必净注射液0.5、2 mL·kg-1·d-1；地塞米松组大鼠给予腹腔注射地塞米松0.5 mL·kg-1·d-1；假手术组采用相同的方式切开阴囊皮肤，不进行睾丸扭转，术后注射相同体积的生理盐水。每日给药1次，连续给药3 d。给药3 d后，采用过度麻醉处死，收集各组大鼠血液和左侧睾丸组织。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 HE染色法观察睾丸组织损伤 将睾丸组织置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋后连续切片，切片厚度为4μm。水浴展片、高温烤片、常规脱蜡至水后进行HE染色。最后采用封片处理，光学显微镜下观察各组大鼠睾丸组织的病理组织学变化。

1.4.2 ELISA法检测血清中炎性因子和TLR4水平 将收集的各组大鼠血液经离心后取血清，采用ELISA检测试剂盒检测血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β）和TLR4水平，应用酶标仪检测各样本在450 nm波长处的光密度（OD）值，然后按照以标准品绘制的标准曲线计算出各指标水平。

1.4.3 生化检测睾丸组织MDA、SOD水平 将收集的睾丸组织进行匀浆后，以900×g离心10 min，收集上清，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，采用羟胺法测定SOD水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。MDA检测时应用酶标仪检测532 nm波长处的OD值，SOD检测时应用酶标仪检测550 nm波长处的OD值，计算MDA和SOD的水平。

1.4.4 TUNEL染色法检测睾丸组织中生殖细胞的凋亡水平 取各组大鼠睾丸组织的石蜡包埋块，连续切片，切片厚度为4μm。经60℃烤片、二甲苯透明、梯度酒精水化后采用20μg/mL蛋白酶K工作液37℃孵育30 min。清洗后，加入50μL TUNEL反应混合液，将玻片置于湿盒中，37℃避光孵育60 min。清洗后，加入50μL转化剂过氧化物酶（POD），继续置于湿盒中37℃避光孵育30 min。清洗后，加入50μL二氨基联苯胺（DAB）底物孵育10 min。继而，苏木素复染、脱水、透明，封片后光镜下观察。计算凋亡指数（500个细胞中凋亡细胞的数量）。

1.5 统计方法采用SPSS22.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血必净改善I/R损伤睾丸组织的病理学变化图1结果显示：假手术组睾丸曲细精管排列紧密，生殖细胞厚度正常，排列紧密有序，结构层次清晰；模型组睾丸曲细精管排列疏松，较为紊乱，细胞层次被破坏，生殖细胞明显减少、脱落；血必净低、高剂量组以及地塞米松组均可见生精细胞排列逐渐恢复正常，细胞层次逐渐清晰明了，少数腔内可见脱落细胞。

图1 各组大鼠睾丸组织病理学变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes of rat testis tissue in various groups（by HE staining，×200）

2.2 血必净改善I/R损伤睾丸组织中MDA和SOD水平图2结果显示：与假手术组比较，模型组睾丸组织中SOD水平显著降低，MDA水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，血必净低、高剂量组睾丸组织中SOD水平明显升高，MDA水平降低（P＜0.05）；地塞米松组与血必净各剂量组趋势一致（P＜0.05）。表明血必净可抑制I/R损伤睾丸组织中的氧化应激反应。

2.3 血必净抑制I/R损伤睾丸生殖细胞的凋亡图3～图4结果显示：假手术组仅见少量的凋亡睾丸生殖细胞；而模型组睾丸中凋亡生殖细胞则明显增多（P＜0.05），凋亡的生殖细胞深染，且凋亡细胞主要为初级精母细胞和精原细胞；与模型组比较，血必净高剂量组和地塞米松组睾丸凋亡细胞明显减少（P＜0.05）。表明血必净能够降低I/R损伤睾丸生殖细胞的凋亡水平。

图3 各组大鼠睾丸组织凋亡生殖细胞分布比较（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic germ cells in rat testis tissue of various group（by TUNEL staining，×200）

图4 各组大鼠睾丸组织生殖细胞凋亡指数比较Figure 4 Comparison of apoptosis index of germ cells in rat testis tissue of various groups

A.SOD水平；B.MDA水平①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

2.4 血必净降低睾丸扭转大鼠血清中炎性因子水平图5结果显示：与假手术组比较，模型组TNF-α、IL-1β和TLR4水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，血必净高剂量组以及地塞米松组TNF-α、IL-1β和TLR4水平均显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

睾丸扭转可导致睾丸组织缺血，需及时采取手术恢复睾丸供血，避免睾丸坏死致使患者丧失生殖能力[11]。然而，睾丸扭转复位，也是一种I/R过程，缺血组织恢复供氧能够引起氧自由基的过度表达，进而将细胞膜脂质物氧化形成有毒物质，如MDA，加剧缺血性睾丸的睾丸组织损伤[11-12]。睾丸I/R能够激活炎症信号通路，促进中性粒细胞从内皮细胞转移至睾丸间质，增加活性氧的产生和炎性因子的释放，导致生殖细胞功能障碍，诱导细胞凋亡[13]，睾丸生精作用受损，那么，如何有效治疗睾丸扭转/复位I/R是目前亟需解决的问题。

血必净是由多种中草药研制而成，包含红花、当归、川芎、丹参以及赤芍等，具有抗炎、增强免疫力、清热解毒等作用[8-9]，对脓毒症、重度肺炎、全身炎症反应综合征以及I/R损伤等均具有一定的保护作用[3，14-16]。有研究[14-15]显示，在重症肺炎患者或左心室I/R诱发急性肺损伤的动物模型中，血必净能够通过降低炎性介质细胞间黏附分子1（ICAM-1）和TNF-α的表达水平发挥抗炎的作用，且血必净能够上调抗氧化指标SOD活性，下调氧化产物MDA含量，进而发挥抗氧化作用[16]。SOD是一种清除氧自由基酶的活性剂，MDA是脂质过氧化物的最终产物，是反映氧自由基损伤的重要指标[17]。本研究结果显示，模型组睾丸组织SOD水平显著降低，MDA水平显著升高，表明I/R状态产生大量的活性氧自由基，介导了细胞膜中脂质过氧化反应，消耗了SOD。与模型组比较，血必净组睾丸组织SOD水平显著增加，MDA含量显著减少，表明血必净可抵抗氧自由基的损害，抑制睾丸I/R脂质过氧化反应。

A.TNF-α水平；B.IL-1β水平；C.TLR4水平①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

有研究[18]显示，TLR4是模式识别受体家族成员之一，能够诱导激活核因子kappaB（NF-κB）信号通路，进而促进炎症因子TNF-α、IL-1和IL-6等的表达，促进炎症反应。这些炎症因子又会产生大量的活性氧自由基、蛋白水解酶等，对组织细胞造成一定的毒性损伤。细胞凋亡是一种由多种因素诱发的程序性凋亡过程，I/R与细胞凋亡有着十分紧密的关系[19-20]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组睾丸组织病理损伤加重，血清中TNF-α、IL-1β和TLR4炎症因子水平上调，凋亡细胞数增多，表明睾丸I/R对生殖细胞造成了损害。而血必净能够明显改善睾丸组织的病理损伤，减少凋亡的生殖细胞数量，同时下调炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR4的水平，表明血必净对I/R睾丸组织具有保护作用。

地塞米松（Dexamethasone）是一种合成的糖皮质激素，作为有效的抗炎药，被临床广泛应用于治疗炎症和自身免疫性疾病，包括风湿性关节炎、炎症性休克和哮喘等[21]。有研究[22]显示，在肾I/R动物模型中，地塞米松能够通过高迁移率族蛋白1（HMGB1）/TLR4、NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的表达。本结果研究显示，血必净与地塞米松治疗效果相当。

综上所述，血必净可通过改善睾丸I/R后睾丸病理损伤，减少受损组织中生殖细胞的凋亡，降低组织中氧化应激反应，抑制炎症因子的表达，从而发挥大鼠睾丸扭转/复位I/R损伤的修复作用。这为临床应用血必净治疗睾丸扭转，减轻患者的睾丸损伤提供一定的理论依据。