自体脂肪来源干细胞治疗慢性创面的研究进展

黎文正，姚思琦综述，汪 虹审校

0 引 言

慢性创面也叫慢性难愈合创面，临床上一般将经过1个月以上正规创面治疗未愈合，也无愈合趋势的创面叫慢性难愈合创面[1]。主要包括各种原因引起的溃疡、压力性损伤、糖尿病创面，而现今各类癌症患者治疗后不愈合的创面也在与日俱增。据估计，慢性创面大约损害了全球 1%～2% 的人口，仅仅在美国就有超过 650 万例确诊病例，慢性创面治疗的过程中给患者和医疗系统都带来了巨大的经济和社会压力，每年支出医疗保健系统超过 200 亿美元[2]。最近我国解放军总医院特色医学中心创面修复科进行的889例体表慢性创面住院患者临床流行病学研究显示仅仅第1次住院患者的人均住院费用就高达10多万元，后续多次治疗的费用对慢性创面患者来说也是一笔不小的开支[3-4]，故此研究和开发慢性创面的新型治疗方法已经成为国内外亟待解决的重大医学问题。近年来兴起的干细胞疗法在世界范围内引起了广泛的兴趣。特别是自体脂肪移植中的ADSCs易于获得，它们可以通过吸脂抽吸或切除脂肪组织来分离，故此保证了干细胞的充足来源，它可以从人体腹部、腿部等处大量提取，而不需要受到伦理学的制约，并且它的供体部位并发症的发病率低[5]。以上这些优点可以最大限度地减少患者的不适并消除耗时的体外扩增步骤。移植自体脂肪来源干细胞带来的慢性伤口治疗新策略将是加速慢性伤口愈合的新希望，值得我们关注。本综述介绍近年来自体脂肪来源干细胞在慢性创面治疗中的可能机制和临床联合应用，旨在为进一步突破慢性创面愈合提供另一种新的思路。

1 ADSCs的概念、来源及功能

自体脂肪移植为慢性创伤患者提供了一种简单而有效的治疗选择，在于其可以输送具有强大再生特性的脂肪干细胞。ADSCs是多能间充质干细胞[6]，具有与其他间充质干细胞相似的分化潜能 ，表现出明确的干细胞特征：在体外扩增时保持多能性和自我更新能力，与骨髓造血干细胞相比，在分离时具有更高的增殖率和更高的产量，并且在长期培养中更具有遗传稳定性。它可以很容易地从任何一种白色脂肪组织中分离出来，或从吸脂获得的脂肪组织中分离。ADSCs移植几乎不会对人体造成伤害，此前从脂肪组织中分离ADSCs大多数借用了实验室或实验室衍生的方法，耗时费力且纯度不高， Raposio等[7]研究者描述了一种相对简单和快速的分离方案，该方案所有步骤都在闭路中进行，以确保最大程度的工艺无菌，一旦通过标准的吸脂程序获得脂肪组织，它就会经历第一次离心，以去除油和浆液部分，再经过两次洗涤和离心，就可以单独获得ADSCs颗粒。将这种ADSCs颗粒移植到皮肤边缘和慢性皮肤溃疡的底部，对创面愈合产生了积极的促进作用。此外，ADSCs的干细胞抗原和标记类似于从脐带和骨髓中分离的干细胞，但与其他来源的干细胞相比，ADSCs具有显著的优势，主要是在于其丰富和易于获取[8]。ADSCs具有多向分化潜能，不仅可以分化为骨细胞、肝细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元，还可以分化为多功能的血管内皮细胞[9]。目前正在进行越来越多的临床研究，以测试它们在各个医学领域的潜力。

2 ADSC治疗慢性创面的机制

自体脂肪移植由于其在创面治疗中的有效性受到越来越多的关注，其中自体脂肪来源干细胞可能是影响创面愈合的最主要因素，其可能机制如下：

2.1多分化功能ADSCs 在促进伤口愈合方面的一个优势是这些细胞具有很强的增值分化能力，可分化为创面愈合必须的内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞。以前的研究已经报道，当 ADSCs 种植到支架上并应用于创面时，显示与成纤维细胞形态相似的结构 ，表明ADSCs 可以分化为成纤维细胞[3]。除此之外， ADSCs 还能分化为角质细胞，Ebrahimian 在大鼠背侧注射 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 转染的 ADSCs 后，经过一段时间后发现表皮和真皮出现 GFP 阳性细胞，并能够表达两种表皮角质形成细胞标志蛋白，细胞角蛋白 CK5 和 CK14，次实验证实 ADSCs 分化为角质形成细胞以增强创面再生[10]。另外Sivan等[11]还发现，通过在含有纤维蛋白复合物的仿生态环境中培养自体ADSCs，可以将 ADSCs分化为角质形成细胞。

2.2促进新生血管形成新生血管的形成在修复严重缺血和组织损伤的创面中起着重要的用,ADSCs 可不断增殖分化为血管内皮细胞，临床上已经用于治疗缺血性血管疾病[12]。而难以愈合的原因主要在于慢性创面血管形成受阻，新血管形成网络不足，造成伤口愈合过程中的细胞提供营养和氧气支持不足[13]。因此，ADSCs 可诱导创面通过发芽的方式从先前存在的血管形成新血管，促进慢性创面愈合。徐建文等将 ADSCs 与 人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)共培养，发现 ADSCs 显著促进了 HUVECs 的增殖和迁移能力以及血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)mRNA 的表达，为ADSCs创面血管化的机制提供了实验基础[14]。Justyna等[15]在小鼠后肢缺血模型上进行的生理或ADSC刺激的缺血组织新生血管过程，实验中观察到当ADSC注射到受伤的肌肉中时，新血管的形成速度更快，密度更高，表明ADSCs通过影响血管形成过程中每个步骤的新生细胞的动力学和比例，进而促进有效的缺血组织新生血管形成。

2.3再上皮化慢性创面暴露会使细菌在皮下组织繁殖，进一步刺激创面部位的慢性炎症，使慢性难愈合创面更难治疗和加大组织修复难度[16]。如创面能适时再上皮化则会促进创面愈合，Kim等[17]在理解ADSCs在组织再生和皮肤伤口愈合过程中的作用方面的突破已经证明ADSCs促进伤口边缘的上皮再形成，促进细胞增殖，并显著减小伤口大小。最近的研究表明，ADSCs通过分泌诱导的旁分泌激活，包括下调基质金属蛋白酶-1和上调I型和III型胶原蛋白和纤连蛋白，以及通过细胞间的直接接触，增强伤口愈合[18]。

2.4分泌多种生物活性因子研究表明[19]，ADSCs通过分泌生长因子和细胞因子来促进皮肤修复和再生，并分化为其他谱系和细胞类型，从而参与伤口愈合过程，ADSCs可以分泌多种生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子、VEGF、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子，调节创面炎症微环境，加速创面局部微-血管化[20]。这些因子被认为加速了正常和慢性伤口的愈合过程。

2.5调节炎症健康皮肤创面愈合是一个复杂且高度调控的过程，包括炎症、增殖、基质形成和重构，当这个过程被打断时，就会形成慢性不可愈合的创面，导致不同严重程度的开放性撕裂[21]。在身体受到损伤和感染时，炎症会立即产生，这对于创面愈合至关重要，随着愈合的进展，炎症会慢慢消失，介导修复和增殖的途径开始[22]。有研究使用 siRNA 消耗 生长抑制特异性基因5(Growth Arrest-specific Transcripts5， GAS5)，结果表明 Toll 样受体 7 表达水平受 GAS5 的调节，进一步确定了受 GAS5 调节的炎症通路[8]。体外研究表明，ADSCs通过分泌可溶性细胞因子和生长因子对伤口愈合有积极作用，且ADSCs的分泌特性特别适用于慢性伤口的病理生理环境，通过分泌旁分泌因子，ADSC可以调节免疫系统，从而下调慢性炎症活动[23]。

3 ADSCs与其他方法联合治疗慢性创面

3.1 ADSCs联合富含血小板血浆 (Platelet-rich plasma，PRP)促进创面愈合以往的研究表明Notch 信号通路是一种进化保守的信号机制，具有极强的多效性作用，此外，它还在调节增殖、血管生成和细胞凋亡/存活等过程中发挥着关键作用，但这些过程却在糖尿病这类慢性难愈合创面中受到严重干扰[24]。Ebrahim 等[25]发现PRP 和 ADSCs 联合治疗在于通过调节 Notch 通路，促进血管生成，触发表皮细胞增殖和募集，此联合显著加速了大鼠实验诱导的糖尿病创面愈合。有趣的是，最近的研究表明，PRP可能为ADSCs提供了一个适宜的促增殖分化微环境[26]。事实上，PRP中存在的生长因子在增强安全、自然的组织愈合方面发挥着基础性作用，临床上一直被用于慢性溃疡、软组织缺损和生长修复[27]。此外，联合脐带血源-ADSCs和PRP治疗在联合放疗和创面损伤模型中可改善再生，增强血管生成[28]。

3.2ADSCs联合内皮细胞分泌体促进创面愈合随着全球糖尿病患病率的增加，预计无法愈合创面的患者数量将会显著增加，然而，现有的治疗方法，如血管重建术和足部护理教育，往往不足以确保令人满意的伤口愈合。自体ADSCs疗法在糖尿病患者中的作用也有限，原因在于干细胞表型受到糖尿病高糖环境的负面影响[29]。不过，Marc 科研团队的工作发现了糖尿病环境中ADSCs功能障碍的潜在病理过程，并确定了用分泌蛋白或HUVECs的分泌体启动ADSCs可以逆转高糖浓度对ADSCs的有害影响，从而增强ADSCs参与血管生成和伤口愈合的能力，该方法显著增强了糖尿病患者因糖尿病足或手术部位感染而产生的慢性创面的愈合率[30]。

3.3ADSCs 联合各种生物敷贴促进创面愈合随着我国人口老龄化进一步发展，因压疮、糖尿病足引起的慢性创面发生率逐年增高，严重影响生活质量。目前，外膜敷贴已经在慢性创面治疗中被广泛应用，外膜敷贴为半透明生物薄膜，主要材料为猪内脏器官膜，通过除抗原、消毒等处理后制作而成，但有研究表明针对慢性创面者单纯给予外膜敷料一种治疗方案，效果欠佳[31]。基于细胞疗法在改善伤口愈合方面有很大的潜力，且不需要进行大的手术程序和造成供区部位愈合后瘢痕增生[32]。鉴于此扬州大学整形外科选用了新型治疗方式，即在常规外膜敷贴基础上采用自体ADSCs治疗，结果提示该方案能显著提高愈合效果，并上调多种创面生长因子水平，包括成纤维细胞生长因子b(fibroblast growth factorb,FGFb)、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)、VEGF等[33]。另外，透明质酸(Hyaluronic acid,HA)作为一种天然存在于人体各种组织中的多糖，如关节、软骨、眼睛和皮肤[34]。 Pak等[35]研究了HA贴片与脂肪来源的ADSCs在糖尿病鼠(diabetes mouse，db)模型中的效果，对组织中CD31和vWF进行了染色，结果显示ADSCs单独或联合HA贴片组均可观察到CD31阳性的小血管，但HA贴片组CD31阳性血管数显著高于ADSCs组。与这些观察结果一致的是，接受HA贴片联合ADSCs治疗的小鼠显示出最多的vWF阳性血管。以上两种生物敷料和ADSCs的结合都进一步说明了联合利用可促进慢性创面上皮化、肉芽组织形成和毛细血管形成。

4 展 望

综上所述，慢性创面除了给患者和治疗专家带来沉重负担外，还对全球医疗体系构成了财务挑战。然而，在某些情况下，慢性创面似乎对治疗具有高度抵抗力，治疗无效或进展缓慢。因此，开发更有效的新的治疗方法是必要的。自体脂肪移植在这方面提供了创新的方法，因为它利用人体自身的资源来修复组织损伤。脂肪组织易于获取，ADSCs产量高，且其修复能力迄今被大大低估，因此该领域的发展前景看好[36]。虽然目前ADSCs的基础研究和临床实践还处于探索阶段，但无论是单一进行ADSCs富集脂肪移植到慢性伤口或者作为一种细胞疗法辅助其它创面治疗方法，其产生的创面治疗效果和缩减医疗支出的前景，都值得广大医疗科研人员在此领域深耕。