维生素D通过调控Traf6/TAK1通路抑制2型糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化

薛 莉 瞿 伟 （南通市中医院，南通 226001）

随着人们生活方式的改变和老龄化社会的加剧，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患病率逐年上升，成为继心脑血管疾病及肿瘤后威胁人类健康的又一严重疾病［1］。糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是T2DM的常见并发症，临床特征为肾小管上皮细胞肥大、肾小管基底膜增厚，进而出现微量白蛋白尿、大量蛋白尿、肾小管间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）及肾小球硬化等，最终导致终末期肾病［2］。其中RIF是终末期肾病最典型的病变，也是多种肾病发展为终末期肾功能衰竭的共同环节，而上皮细胞间充质转分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是形成RIF的主要病变途径。因此抑制EMT对预防慢性肾病具有重要价值［3］。肿瘤坏死因子受体相关分子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，Traf6）是Toll样受体家族成员，参与介导Toll样受体与肿瘤坏死因子受体的信号传导，Traf6可以使转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1）磷酸化，进而诱导炎症、凋亡及氧化应激的发生［4-5］。另外Traf6还参与肾小管上皮细胞转分化过程［6-7］。维生素D（vitamin D，Vit D）是脂溶性维生素，活性形式为25-羟维生素D3［25-（OH）D3］，其主要来源于食物或由暴露在紫外光下的皮肤合成。近年来研究发现Vit D对胰岛细胞具有一定的保护作用，Vit D是否影响DKD患者肾小管EMT鲜有报道。

本研究通过观察Vit D对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的DKD大鼠Traf6/TAK1信号通路的调控作用、炎症反应及肾小管EMT的影响，进一步探究Vit D在DKD发生、发展中的作用，为Vit D临床防治RIF提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 48只8周龄、体质量为（250±10） g的SPF级SD雄性大鼠购自北京生物制品研究所有限责任公司，生产许可证号为SYXK（京）2020-0031。饲养环境为室温23 ℃、标准湿度60%、12 h/12 h昼夜交替、正常供给饲料和饮用水、分笼饲养。饲养1周后用于实验。本研究实验经医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 STZ（美国Sigma公司）；骨化三醇胶丸（上海罗氏制药有限公司）；E-cadherin抗体（美国Protein-tech公司）；α-SMA抗体（美国Selleck公司）；Traf6、p-TAK1抗体（美国CST公司）；辣根过氧化物酶标记的二抗（北京博尔西科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；TGF-β1抗体、ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Thermo酶标仪（上海热电仪器有限公司）；组织包埋机（德国Leica公司）；台式冰冻离心机（美国Beckman公司）；蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；便携式血糖监测仪（德国ACCU-Chek公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组和留样 将48只大鼠随机分为对照组（Control组）、模型组（Vehicle组）、治疗组（Vit D组）。模型制作：Control组喂普通饲料，Vehicle组及Vit D组喂高脂高糖饲料（饲料配方：10%炼猪油，20%蔗糖，2%胆固醇，8%蛋黄粉，60%普通饲料），6周后Vehicle组及Vit D组大鼠空腹12 h后腹腔注射小剂量STZ（30 mg/kg）。注射3 d后，随机检测血糖，连续3次非同日尾静脉注射≥16.7 mmol/L STZ为T2DM大鼠。T2DM成模大鼠在STZ注射后6周和7周时检测晨尿中微量蛋白含量，若连续3次以上为阳性，则为DKD大鼠。DKD大鼠建模成功后，Vit D组给予0.03 µg/（kg·d）骨化三醇（溶于0.05 ml花生油）灌胃8周，Vehicle组给予等量花生油灌胃，Control组不做任何处理。8周后收集大鼠24 h尿液，测定24 h尿蛋白含量及尿量。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（3 ml/kg）麻醉大鼠，心脏穿刺取血，分离血清，保存于-20 ℃备用，测定FBG、血肌酸酐、血尿素氮含量。处死大鼠后，分离两侧肾，取皮质部分，切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，部分用4%多聚甲醛固定，部分浸入RNA later液中，置于-80 ℃保存待测。

1.2.2 生化指标检测 采用德国ACCU-Chek血糖仪测定FBG，Olympus全自动生化分析仪检测尿蛋白、血肌酸酐、血尿素氮。采用ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.2.3 HE染色观察肾脏组织形态学改变 取出用4%多聚甲醛固定的肾脏组织，进行脱水透明、石蜡包埋、脱蜡等操作，苏木素染色5～6 min，伊红染液染30 s，之后乙醇梯度脱水、透明、中性树胶封片，显微镜（×400）下观察大鼠肾脏组织病理学改变。

1.2.4 Masson染色观察肾脏组织纤维化改变 切片进行常规脱蜡，苏木素染色10 min，丽春红酸性复红液染色5 min，磷钼酸溶液分化5～10 s，亮绿染色6～8 min，乙醇梯度脱水，中性树胶封片，显微镜（×400）下观察大鼠肾脏组织纤维化程度。

1.2.5 免疫组化观察肾脏 E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表达 石蜡切片经60 ℃熔蜡、二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水后，进行高压抗原修复，分别滴加一抗E-cadherin、TGF-β1、α-SMA（1∶200）孵育过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记）孵育20 min，DAB显色液显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水、透明、封片，显微镜（×200）下镜检。阳性染色为棕黄色，随机选取5个视野，利用Image J软件进行阳性面积统计。

1.2.6 Western blot法检测Traf6、p-TAK1蛋白的表达 取冻存的肾脏组织，加入RIPA裂解液，超声匀浆提取总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白沸水浴变性，取等量变性后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，用含5%脱脂牛奶死亡 TBST封闭 2 h，加入一抗 Traf6、p-TAK1（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，用ECL化学发光剂进行显影，以GAPDH作为内参校正，Image J软件进行发光结果的灰度分析。

1.3 统计学分析 数据统计采用SPSS16.0软件，作图工具采用Graphpad5.0，计数资料采用n（%）表示，两组间比较采用χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及血糖、肾脏指标比较Control组大鼠毛色顺滑有光泽，饮食、饮水、尿量正常，体质量稳定增长，活动正常。给予高脂高糖喂养，腹腔注射STZ后，Vehicle组大鼠毛发暗淡无光泽，逐渐出现多饮、多食、多尿情况，逐渐消瘦，反应迟钝，活动减少。给予骨化三醇灌胃后，Vit D组大鼠情况有所改善，毛发逐渐润泽，饮食、饮水、尿量正常，精神逐渐恢复，体质量稳定增长。

与Control组相比，Vehicle组大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与Vehicle组相比，Vit D组大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比较（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

表1 各组大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比较（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with vehicle group， 2）P＜0.05.

Groups Control Vehicle Vit D FBG/（mmol·L-1）5.7±0.35 17.6±2.131）12.4±1.852）Creatinine/（µmol·L-1）97.85±7.32 146.36±8.441）121.75±6.242）Urea nitrogen/（mmol·L-1）5.23±0.45 9.16±0.761）7.56±0.682）24 h urine protein/mg 12.54±4.65 46.23±8.411）28.14±6.522）24 h urine volume/mg 23.56±6.32 126.85±9.341）76.24±8.462）

2.2 各组大鼠炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量比较 ELISA结果显示（图1），与Control组相比，Vehicle组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平明显升高（P＜0.05）；与Vehicle组相比，Vit D组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 各组大鼠炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量Fig.1 Levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β and TNF-α in each group of rats

2.3 各组大鼠肾脏组织形态学改变比较 HE染色结果显示（图2），Control组大鼠肾小球、肾小管形态规则，囊壁结构完整；Vehicle组肾小球形态不规则，出现黏连、硬化，部分肾小管扩张，发生坏死，无囊壁结构，有明显的炎症细胞浸润；Vit D组大鼠肾小球形态较规则，细胞数增多，肾小管水肿，有轻度扩张和炎症细胞浸润，囊壁结构完整。

图2 各组大鼠肾脏组织形态学改变（×400）Fig.2 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.4 各组大鼠肾脏组织纤维化改变比较 Masson染色结果显示（图3），Control组大鼠肾脏为大量红染的正常肾脏组织，Vehicle组大鼠出现部分蓝染的胶原纤维；Vit D组大鼠呈现散在蓝染的胶原纤维。

图3 各组大鼠肾脏组织形态学改变（×400）Fig.3 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.5 各组大鼠肾脏组织E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表达比较 免疫组化染色结果显示（图4），E-cadherin、TGF-β1、α-SMA蛋白阳性表达均呈棕黄色，Control组大鼠E-cadherin蛋白在肾小管上皮细胞呈强阳性表达，TGF-β1在肾小球和肾小管上皮细胞少量阳性表达，α-SMA在肾小管周围和间质散在表达；与Control组相比，Vehicle组大鼠E-cadherin蛋白表达显著减少，TGF-β1、α-SMA蛋白表达显著增加；与Vehicle组相比，Vit D组E-cadherin蛋白表达显著增加，TGF-β1、α-SMA蛋白表达显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 各组大鼠肾脏组织E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表达Fig.4 Expression of E-cadherin， TGF-β1 and α-SMA in kidney tissues of rats in each group

2.6 各组大鼠肾脏组织Traf6、p-TAK1蛋白表达比较 Western blot结果显示（图5），与Control组相比，Vehicle组大鼠血清Traf6、p-TAK1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与Vehicle组相比，Vit D组大鼠Traf6、p-TAK1蛋白表达水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图5 各组大鼠肾脏组织Traf6、p-TAK1蛋白表达Fig.5 Expressions of Traf6 and p-TAK1 protein in kidney tissues of rats in each group

3 讨论

DKD是由糖尿病引起的微血管病变进而导致的肾小球硬化症，是慢性肾病和肾衰竭的常见病因。其中RIF是进展为终末期肾病的必经途径，而EMT是促进RIF的重要途径。因此探索缓解肾小管EMT及纤维化的药物，对于改善肾脏疾病具有重要意义。近年来Vit D对DKD的保护作用备受关注。研究表明Vit D能够减少肾脏足细胞肥大，减轻蛋白尿及肾小球硬化，抑制炎症因子的表达及巨噬细胞浸润等，能有效缓解DKD大鼠肾脏损伤［8］。张晓玲等［9］发现缺乏Vit D与DKD的发生、发展有关，补充Vit D有助于DKD的治疗。本研究中Vehicle组大鼠与Control组相比，毛发暗淡无光泽，出现多饮、多食、多尿情况，逐渐消瘦，反应迟钝，活动减少，FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白等指标水平显著升高，肾小球出现黏连、硬化，部分肾小管扩张、坏死，说明制作DKD大鼠模型成功。给予Vit D干预后，Vit D组大鼠情况有所改善，毛发逐渐润泽，饮食、饮水、尿量正常，精神逐渐恢复，体质量稳定增长，FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明显下降，肾小球形态较规则，肾小管有轻度扩张。说明Vit D能有效改善DKD损伤，与以往研究结果一致。

肾脏组织长期浸润在高血糖环境中，能够引起炎症细胞过量分泌，从而激活核因子、丝裂元活化蛋白激酶家族（MAPKs）等多种炎症信号通路，诱发TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的分泌［10］。TNF-α能够损伤肾小管内皮细胞，造成细胞外基质沉积，导致 RIF［11］。IL-1、IL-6 可促进肾小球系膜细胞增殖，导致细胞外基质分泌增多和沉积［12］。Vit D能够改善DKD炎症状态，通过上调IL-10等抗炎因子及抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的表达调节炎症的平衡［13］。赵耀等［14］发现高血糖能引起肾脏组织炎症反应，DKD大鼠较正常组TNF-α和IL-6含量显著上升。本研究中Vehicle组大鼠TNF-α、IL-6水平明显升高，经过Vit D干预后，TNF-α、IL-6水平明显降低，说明Vit D能够减轻DKD大鼠炎症反应，改善肾脏病理损害。

EMT发生后会迁移至间质区域，分泌大量细胞外基质，促进RIF的发生［15］。其中E-cadherin是肾小管上皮细胞的标志物，能够维持肾脏上皮结构及功能，其表达减少是发生EMT的早期事件。TGF-β1是公认的EMT发生诱导剂，能够单独引起并参与整个EMT过程，从而诱导纤维化的发生。α-SMA是间充质细胞的标志物，会随着肾脏成纤维细胞的激活而增多。赵宇等［16］研究发现高盐能通过增加TGF-β1、α-SMA的表达诱导EMT的发生，从而促进大鼠肾脏纤维化。韦建辉等［17］发现高糖通过下调E-cadherin的表达，上调α-SMA的表达，成功诱导HK-2细胞发生EMT。白雪峰等［18］发现低氧诱导因子-1α通过上调TGF-β1、α-SMA的表达，降低E-cadherin的表达，促进牦牛肾小管EMT的发生。本研究中Vehicle组大鼠TGF-β1、α-SMA的表达升高，E-cadherin的表达降低，且大鼠肾脏组织出现部分蓝染的胶原纤维；经过Vit D干预后，TGF-β1、α-SMA的表达水平明显降低，E-cadherin的表达明显增加，且呈现散在蓝染的胶原纤维，说明Vit D能够降低DKD大鼠EMT发生，从而抑制RIF。

TRAF6是一种衔接蛋白，在胞外信号刺激下TRAF6被激活，进而使下游TAK1发生磷酸化，将胞外信号传至胞内诱导炎症反应。研究发现，小鼠体内过表达TRAF6基因，会增加TAK1磷酸化水平，进而激活NF-κB信号通路，诱导细胞氧化损伤、炎症反应及细胞凋亡的发生［19］。沈先敏等［20］发现槲皮素通过抑制TRAF6/TAK1信号通路的活化，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的表达，从而改善脂多糖诱导的BV-2细胞炎症损伤。李霖等［21］发现萝卜硫素通过抑制Traf6/TAK1通路，抑制脂多糖诱导的HK-2细胞炎症因子的产生，以及抑制肾小管EMT。本研究中Vehicle组较Control组TRAF6、TAK1的表达增加，Vit D干预后，TRAF6、TAK1的表达较Vehicle组降低，推断Vit D对DKD的保护作用可能是通过抑制TRAF6/TAK1信号通路实现的。

综上所述，Vit D能够有效改善DKD损伤，抑制机体炎症反应及肾小管EMT的发生，从而抑制RIF，可能通过抑制TRAF6/TAK1信号通路发挥对DKD大鼠的保护作用。