自组装多肽在生物医药领域的研究进展

刘旭，尹彩云，陈海燕，朱颐申

南京工业大学生物与制药工程学院，南京211816

分子自组装[1]是指分子通过分子间的相互作用形成具有有序结构的聚集体，表现出单个分子或低级分子聚集体所没有的特性与功能。分子自组装的发现促进了材料、化学、生物等学科的交叉融合，是近年来备受关注的研究领域。

1993 年美国麻省理工学院的张曙光博士[2]从酵母蛋白中发现了一个异乎寻常的具有自组装成β-折叠的离子互补型多肽（AEAEAKAK）2；同年，Engels M 等[3]通过交替改变氨基酸的空间结构，设计并合成了可在水溶液中自组装形成纳米管状结构的环肽cyclo-[（QDAEDA）2]，自此开拓了多肽自组装的新领域。多肽自组装是分子自组装的重要组成部分，与其他纳米材料相比，自组装多肽具有良好的生物相容性、易改造、可降解以及免疫反应低等特性[4]。近年来随着研究的不断深入，自组装多肽已被广泛用于药物递送、组织修复、临床治疗等方面[5]。本文介绍了组装多肽在药物递送、生物医学检测、组织工程、疫苗工程等方面的应用。

1 自组装多肽的概念、设计原则、分类及分析方法

多肽自组装指多肽通过非共价键（如氢键、疏水作用、范德华力、π-π 堆积作用等）自发组装成高度有序的纳米结构[3]，这种组装结构具有环境响应性、优良的生物相容性和生物降解性。

自组装多肽的分子设计，是利用多肽分子间或分子片段间非共价键作用，形成具有特定排列顺序的分子聚集体[4]，其中非共价键相互作用是多肽分子发生自组装的关键[5]。在设计自组装多肽时，应遵循的分子设计原则包括：①非共价键相互作用能维持自组装多肽的结构稳定性和完整性，使自组装体系的能量最低；②多肽分子间空间体积和电性互补，能够实现空间尺寸和方向的重排与堆积[6，7]。制备自组装多肽目前主要采用化学合成法，包括固相合成法、液相合成法和固-液相结合合成法[8]。

根据自组装过程是否需要外界环境调控，自组装多肽可分为自发型和触发型两种。自发型指多肽溶解于水溶液时可自发地形成组装结构，如Cavalli S 等[9]设计的两亲性脂肽（ALPs），包含疏水性的磷脂结构及亲水性的多肽序列（LE）4，可在水中自组装成β 折叠的纳米纤维结构。触发型指多肽在pH、温度、光照、酶等环境条件诱导下形成组装结构[10-12]，如Yang ZM 等[13]设计的两亲性多肽Nap-FFGEY，其在非共价键作用下自组装成纳米纤维结构，加入磷酸激酶使酪氨酸（Y）位点磷酸化，形成亲水性增加的Nap-FFGEpY，该磷酸化多肽破坏了自组装结构；进一步加入磷酸酯酶使其去磷酸化，从而恢复自组装纳米纤维结构。磷酸激酶和磷酸酯酶交替调控多肽的磷酸化和去磷酸化，进而调节Nap-FFGEY 的自组装行为。

自组装多肽的分析研究多集中于物性力学表征和体内外活性等方面，质控分析报道较少。其表征包括表面形貌、粒径、流变学特性和结构分析等。自组装多肽纳米结构的表面形貌观察[14]主要利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、低温TEM 和原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）进行研究。动态光散射研究[15]用于分析自组装多肽粒径分布。流变学特性采用锥板、平行板或转筒流变仪进行表征，通常测试弹性模量（G′）（也称储能模量）和黏性模量（G″）（也称损耗模量），随剪切应力、频率、时间、温度等的变化规律。结构分析可通过液质联用、圆二色谱（circular dichroism，CD）、傅里叶变换红外光谱、核磁共振和X 射线散射/衍射技术进行研究。自组装多肽体外评价方法包括酶动力学、结合力测定、生物活性测定，其中酶动力学测定采用酶促反应；采用生物膜层干涉技术[16]（bio-layer interferometry，BLI）和表面等离子共振技术[17]（surface plasmon resonance，SPR）测定多肽分子之间的结合力；采用均相时间分辨荧光技术[18]（homogeneous time resolved fluorescence，HTRF）检测多肽刺激细胞后产生的化学物质测定生物活性等。自组装多肽体内评价一般采用动物或动物器官，作用机理明确的检测相关生物标志物，作用机理不明确则观察治疗效果，如利用小鼠心肌梗死模型（myocardial infarction，MI）研究自组装多肽RADA16-SVVYGLR 对心肌修复效果[19]。

2 自组装多肽在生物医药领域的应用

2.1 药物递送

近年研究发现，自组装多肽因其生物相容性、生物降解性和多功能性，可作为一种高效的物质递送系统，向体内转运小分子或蛋白质药物、细胞因子、抗原、遗传物质等，从而提高难溶药物的生物利用度，增强化疗药物的选择性，延长药物作用时间，显著改善药物的理化性质及生物学活性等，用于药物开发和临床治疗[20]。

2.1.1 抗肿瘤药物递送 近年来利用自组装多肽制备纳米管、纳米颗粒、纳米囊泡、纳米纤维和纳米胶束，封装了多种类型的抗肿瘤药物[21，22]，包括阿霉素[23]、姜黄素[24]、氟尿嘧啶[25]和紫杉醇[26]等，在临床前或临床试验中用于癌症治疗[27]。

Gong ZY 等[28]以抗癌药阿霉素为疏水模型药，使用两亲性多肽L6K4在中性条件下自组装形成球形纳米颗粒包封阿霉素，它巧妙利用人宫颈癌细胞（Hela）的酸性微环境来破坏pH 响应的L6K4自组装纳米颗粒结构，使载药纳米颗粒膨胀裂解，实现48 h内阿霉素持续释放。L6K4负载的阿霉素更易被HeLa细胞摄取，致其癌细胞存活率显著低于经游离阿霉素处理的细胞，表明L6K4包封阿霉素能对肿瘤细胞产生特意性损伤作用，减少了游离阿霉素对正常细胞的毒性。即这种酸响应诱导的自组装多肽纳米颗粒作为一种新颖的抗癌药物递送系统初步可行。

2.1.2 中枢神经系统药物递送 由于血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的阻碍，将治疗性多肽或蛋白质递送至中枢神经系统（central nervous system，CNS）成为目前治疗CNS 疾病的主要挑战。Cheetham AG 等[29]构建了一种修饰多肽自组装的药物递送系统，可将药物透过BBB 或经鼻腔向CNS递送。

内啡肽-1（endomorphin-1，EM-1，序列：YPYFNH2）是一种μ 阿片受体激动剂，但其降解性和有限的膜通透特性限制了临床应用[30]。Liu H 等[31]设计了两亲性EM-1 衍生物C18-SS-EM1 为多肽递送载体，在水中自组装成球形纳米颗粒，小鼠尾静脉注射后在血浆中不易被降解，透过BBB 后多肽递送载体的二硫键断裂释放EM-1。近红外荧光成像显示，亲脂性二烷基碳菁类染料（dialkylcarbocyanines，DiR）标记的C18-SS-EM1 纳米颗粒在大脑中的荧光强度明显高于游离EM-1，表明C18-SS-EM1 透过BBB 到达CNS 部位起效。这种自组装多肽递药系统是一种有效的CNS 药物递送形式。

神经肽S（neuropeptide S，NPS，序列：SFRNGV GSGAKKTSFRRAKQ）具有较强的抗焦虑活性，然而其代谢稳定性差，不能透过BBB，导致应用受限[32]。经鼻药物递送可使脂质修饰的NPS 作为多肽递送载体直接从鼻腔递送到大脑而不涉及血脑屏障。Li S等[33]用棕榈酸修饰NPS 得到可自组装形成α 螺旋纳米纤维的M-3，α 螺旋结构可保护NPS 在经鼻腔递送到大脑作用部位时不易被酶解。离体荧光成像结果发现，小鼠鼻内注射近红外花青素荧光染料（cyanine 7，Cy7）标记的Cy7-M-3 和Cy7-NPS，4 h后脑内Cy7-M-3 荧光强度显著高于Cy7-NPS，这表明M-3 具有更好的膜穿透性和稳定性，并在脑内发挥作用。脂质修饰多肽类药物自组装给药系统改善了多肽代谢稳定性差、易受酶降解的不足，有望用于CNS 的药物递送。

2.1.3 心血管药物递送 RADA16 和EAK16 等自组装多肽可促进内皮细胞粘附生长、血管生成和胚胎干细胞分化[34]，通过在氨基或羧基末端修饰生物活性多肽序列，可获得更好的生物学作用。

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一种G-肌动蛋白螯合肽，已被证实可促进心肌梗死后的血管和心肌生成[35]。Wang YL 等[36]将多肽RPRHQGVM（RPR）与RGD 偶联到RADA16-I（RADA）C端，得到一种新的功能化自组装多肽RADA-RPR，Tβ4 包埋于自组装纳米颗粒中，得到RADA-RPR-Tβ4。在小鼠MI 模型内注射RADA-RPR-Tβ4，Tβ4 降解缓慢。与游离Tβ4 相比，RADA-RPR-Tβ4 释放时间延长。研究发现，RADA-RPR-Tβ4 显著改善了小鼠的心脏收缩功能，心肌梗死区域有大量的血管和淋巴管生成，存活心肌增多，梗死面积和瘢痕面积也明显减小，表明自组装多肽载药能够在心肌促进血管细胞募集和血管形成。

2.2 生物医学检测

自组装多肽能够特异性识别病灶部位高表达的生物标志物，实现疾病的精确诊断和有效治疗[37]。通过原位和异位构建组合各种成像物（即放射性同位素、荧光发色团等）的自组装多肽，已开发出多种高度特异性的自组装多肽类探针，成为医学检测和成像的重要方法。

在肿瘤诊断方面，肿瘤细胞相比正常细胞处于快速增殖的状态，部分酶在肿瘤细胞中高表达，如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。根据这一特点，可制备基于酶诱导的原位自组装多肽探针用于肿瘤早期诊断。Zhong YL 等[38]将具有ALP 催化位点的Nap-GFFKpYD 与荧光分子7-二乙氨基香豆素-3-羧酸（（7-（diethylamino）coumarin-3-carboxylic acid，Cou）共价结合获得Nap-GFFK（Cou）pYD，荷瘤裸鼠尾静脉注射后，肿瘤部位高表达的ALP 使Nap-GFFK（Cou）pYD 的磷酸基团脱去，触发自组装，在背部肿瘤区域聚集形成发光纳米纤维，荧光强度随时间推移而特异性增强，说明了Nap-GFFK（Cou）pYD可以靶向到达肿瘤部位。这种具有酶响应性的原位自组装多肽荧光探针可高效鉴别肿瘤细胞及肿瘤组织，有望成为肿瘤早期诊断的分子成像工具。

Fan Z 等[39]研究发现，WF 二肽自组装成纳米颗粒（dipeptide nanoparticles，DNPs），将多肽的荧光信号从紫外区红移至可见光区，用癌细胞表面高表达的黏蛋白-1（Mucin-1，MUC1）配体修饰DNPs，可以识别位于人肺癌细胞（A549）细胞膜上过表达的MUC1 蛋白，表明DNPs 能够用于癌症生物成像。

此外，随着抗生素滥用现象增加，细菌耐药性问题日益突出，迫切需要实时准确诊断细菌感染的工具。Yang C 等[40]以自组装多肽FF 为骨架，以聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）为响应性荧光开启基序的发光源，以万古霉素（vancomycin）为靶向基团识别革兰阳性菌，设计了多肽-AIE 偶联物细菌靶向探针，用于诊断和治疗革兰阳性菌感染。AIE 分子单体不发光，仅在聚集状态下呈现明显的荧光增强现象，多肽自组装促进AIE聚集，从而诱导AIE 发光，同时AIE 通常具有大共轭体系,其强疏水性提供了自组装驱动力，分子间π-π 相互作用能够稳定自组装结构，强化多肽探针的自组装能力。当细菌感染时，万古霉素修饰的FF可以特异性地结合革兰阳性菌细胞壁中的DADA 序列，从而诱导探针分子自组装，限制AIE 的分子内旋转而开启荧光，同时自组装能够增强AIE 产生活性氧的能力，最终实现对革兰阳性细菌的体内外特异性检测和高效光动力杀灭作用。

2.3 疫苗工程

以自组装纳米材料作为载体，其提供的微环境可能有助于与抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APCs）相互作用，有助于预防疾病和开发免疫治疗疫苗[41]。多肽疫苗设计主要集中在利用抗原蛋白的特定修饰差异以提高选择性免疫应答，提高免疫原性。

Q11（Ac-QQKFQFQFEQQ-NH2）是一种在疫苗工程中常用的自组装多肽，Q11 在盐溶液中通过非共价键作用可以自组装成β 折叠的纳米纤维结构。Li SJ等[42]研究了自组装纳米载体改善多肽抗原疫苗的免疫原性，将可识别细胞毒性T 淋巴细胞的HPV16 E744-62（HPV16 型E7 癌蛋白44-62 序列QAEPDRAHYNIVTFCCKCD），抗原肽通过共价键连接在Q11 氨基端，在盐溶液中通过自组装折叠形成高效呈递抗原表位的纳米纤维疫苗E744-62-Q11，从而提高抗原肽疫苗的免疫原性。小鼠皮下异位移植肿瘤细胞TC-1 模型，分别接种E744-62-Q11 疫苗和Q11，结果显示，E744-62-Q11 组小鼠肿瘤重量显著低于Q11组，肿瘤治愈率高达66.7%，且小鼠脾脏淋巴细胞中E7 特异性分泌干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的T 细胞水平更高，在肿瘤小鼠体内可以显著诱导抗肿瘤细胞免疫应答。此外，E744-62-Q11 在小鼠体内具备良好的安全性，有望转化为治疗HPV 肿瘤的新型纳米疫苗。

Song YQ 等[43]设计并合成了两对形态不同的自佐剂多肽疫苗，多肽疫苗通过自组装五肽FF-Amp-FF（AmpF）或FFPFF（PF）与E7 片段结合，形成两种纳米纤维疫苗AmpF-E7（AmpF-E749-57和AmpFE744-57）和两种纳米颗粒疫苗PF-E7（PF-E749-57和PFE744-57）。多肽疫苗诱导树突状细胞（dendritic cell，DC）的成熟，抗原呈递的免疫学结果显示，所得多肽疫苗具有自佐剂特性。与PF-E7 相比，AmpF-E7 在DC 中内化增强，保留时间延长，因而其在DCs 成熟、淋巴结聚集、细胞毒性T 淋巴细胞浸润肿瘤组织，以及最终溶解肿瘤细胞等方面的性能更高。在流式细胞术和细胞摄取实验中，用多肽疫苗AmpF-E7 处理细胞的定量荧光强度明显高于游离抗原，证明纳米纤维多肽疫苗能改善细胞对抗原的摄取。

2.4 细胞培养

自组装多肽水凝胶可提供类似细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的微环境，有利于细胞的黏附、增殖、迁移和分化，可用于细胞的体外培养。

Fukunaga K 等[44]设计的多肽E1Y9（Ac-EYEYKYEYKY-NH2），可在含钙离子溶液中自组装成具有β 折叠构象的纳米纤维，进而形成水凝胶。具有钙离子响应的E1Y9 自组装多肽水凝胶可以制备出串状和球形水凝胶，这种球形水凝胶不仅提供了与细胞相容的环境，还可以模拟自然组织或器官形状，为细胞创造良好的结构支撑，适用于细胞的3D 培养。Tsutsumi H 等[45]通过将E1Y9 与生物活性部分偶联，进一步设计了E1Y9 的衍生物E1Y9-RGDS（Ac-EYEYKYEYKY-GGG-RGDS -NH2）。E1Y9-RGDS 保持了多肽的自组装特性，且在将其与成纤维细胞3T3-L1 共同培养时发现，E1Y9-RGDS 水凝胶会促进3T3-L1 的粘附和分化，而且不会引起免疫反应和组织炎症。

Ai S 等[46]设计的自组装多肽Biotin-DFYIGSRGD 可在溶液中自组装成超分子多肽水凝胶（supramolecular peptide hydrogel，SupraGel），将人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠乳腺癌细胞4T1 以及小肠干细胞ISCs 分别与SupraGel 培养时发现，3 种细胞都可以有效地分裂成细胞球体，且该球体形态可以提高细胞存活率，增加生长因子的分泌和保持细胞的多功能性。与传统的2D 培养细胞相比，3D 培养细胞球明显更能模拟天然组织和体内环境，从而在细胞生物学研究、组织工程和药物筛选中发挥更大的应用潜力。

2.5 组织工程

组织工程方法由3 个关键要素（支架、细胞、生长因子）组成[47]，其中支架是提供细胞仿生环境的关键。自组装多肽支架因有良好的生物相容性、可调控的生物降解性，已用于神经、脊髓和骨组织工程中。

在神经组织工程方面，支架材料能与神经细胞良好相容，诱导轴突的发生与延长，抑制瘢痕组织的形成。N-钙粘蛋白由神经细胞表达，控制神经网络中轴突引导，突触形成，突触结构的调节以及星形胶质细胞与突触接触等[48]。Kaur H 等[49]合成了N-钙粘蛋白模拟多肽衍生物Fmoc-HAVDI 和Nap-HAVDI，证实了Fmoc-HAVDI 和Nap-HAVDI 水凝胶支持大鼠胶质瘤细胞C6 的粘附、增殖和迁移，表现出在神经组织工程中的应用潜力。

在脊髓组织工程方面，支架可提供脊髓邻近细胞生长的环境和空间，指引神经元轴突延伸，防止外界成分干扰和瘢痕形成，使新生组织接近于正常组织结构。脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏会导致炎症和神经胶质瘢痕形成，从而抑制轴突生长，并降低移植到损伤部位支架的有效性。Tran KA 等[50]研究了RADA 自组装多肽纳米纤维支架对大鼠脊髓损伤的修复，表明其可以减少脊髓损伤大鼠的炎症和神经胶质瘢痕形成，并增加损伤移植部位的轴突密度，减小脊髓损伤区域的面积，证明载细胞自组装多肽支架可用于脊髓损伤的修复。

在骨组织再生方面，自组装多肽对骨质疏松症和软骨缺损等骨组织疾病具有理想的治疗效果。Li L 等[51]将自组装多肽水凝胶（self-assembling peptide hydrogel，SAPH）涂覆在聚己内酯（polycaprolactone，PCL）支架上，一方面提供了SAPH 纳米纤维和微米纤维网络，形成有利于骨和软骨细胞生长的仿生ECM 微环境，另一方面SAPH 显著改善了PCL 表面疏水性，有利于细胞黏附和ECM 沉积，实现了兔关节腔骨和软骨缺损的同步修复。SAPHPCL 为骨和软骨缺损修复提供了一种新的治疗方法，在软骨再生医学领域具有潜在的开发价值。

3 总结与展望

目前已有多种自组装多肽产品用于细胞培养和组织工程研究，如用于细胞3D 培养的PuraMatrix（RADA16），手术止血剂PuraStat（RADA16），用于子宫修复、心肌梗死治疗、骨修复和慢性糖尿病溃疡修复的Sciobio-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ和-Ⅳ（EAK16）等。作为Ⅲ类医疗器械，PuraStat 在欧洲、澳大利亚、新西兰、东南亚等地均有销售；Sciobio 系列产品在中国、欧洲、北美等地均有销售应用。

综上，自组装多肽因其特有的性质，在药物递送、生物医学检测、组织工程、疫苗工程等各领域显示出广阔的应用前景。然而，多肽自组装技术也面临着较多挑战：自组装原理和机制还需深入研究；自组装结构易受环境因素影响；自组装多肽水凝胶的机械性能较低；生产成本较高，大规模生产面临较大困难；生物安全性有待更全面地研究；需进一步探寻自组装多肽生物学作用的评价体系等。