外排泵系统与幽门螺杆菌抗生素耐药性的研究进展

童 静，李昌平

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院消化内科，四川 泸州 646000)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，HP)是一种革兰阴性慢性感染性致病菌，2017年有研究报道全球HP感染率已超过50%，被认为是全球常见的感染细菌之一[1]。HP可引起胃十二指肠疾病及血液系统疾病等[2]，而通过根除HP感染，不仅可以减少消化性溃疡等疾病治愈后的的复发，还能在一定程度上降低胃癌发生率[3]。《Maastricht V/Florence幽门螺杆菌感染处理共识报告》提出，一旦感染HP应进行根治性治疗[4]。在我国，耐药菌株发生率随着抗生素的不规范使用呈现逐步上升趋势。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星等常用抗生素对HP的耐药率分别为 40%～70%、20%～50%以及 20%～50%，且存在一定的区域差异性，同时HP多重耐药率正处于逐年上升中[5]。因此，解决HP感染的根本在于如何解决相关抗生素的耐药性。本文就HP抗生素耐药性及其外排泵系统的研究进展作一综述，旨在为临床治疗耐药HP感染提供一定思路。

1 抗生素耐药性

抗生素耐药性可以通过开发新的抗生素或减少细菌耐药性来解决，然而抗生素耐药性持续增加，最终可能会超过新的抗生素被开发的数量。HP通常是一种细胞外的非侵袭性致病菌，它可以通过复杂的过程改变胃上皮细胞之间紧密的细胞连接，藏在细胞内，以保护它不受抗生素根除治疗的影响[6]；HP还具有较高的遗传变异性，易产生抗生素耐药基因，对各种抗生素具有很强的耐药性，常导致根除失败。因此，患者不得不接受许多后续治疗，增加了治疗成本和时间。当第1次治疗失败后，患者体内容易产生抗生素耐药性，为后续相关治疗增加了一定难度[7]。细菌耐药性是宿主和细菌之间一个复杂的过程，可能与药物靶点突变，外排泵表达增强，膜通透性改变等机制有关[8]。事实上，细菌在进化过程中，一些关键功能蛋白会发生突变，如核酸合成、氧化还原系统和蛋白质翻译等，从而导致抗生素耐药[9]。外排泵活性和细胞膜通透性的改变将影响抗生素在细胞中的积累，进而影响抗菌药物的活性[10]。此外，细菌可以通过产生使抗生素失活的酶或释放毒力因子来影响抗生素的活性[11]。以上机制在细菌耐药过程中并不是孤立存在的，外排泵活性的增加可能会增加细菌耐药基因的突变率[12]。

2 外排泵系统的介绍

2.1 细菌外排泵系统的组成 细菌外排泵是细菌耐药性的主要机制之一[13]。细菌外排泵系统包括一系列转运体，也称为多药转运体，其作用机制是将抗菌药物排出细胞外，大大降低了该抗菌药物的浓度，继而产生耐药性。目前研究发现，与HP相关的外排泵系统可分为五大家族：RND家族、MFS家族、ABC家族、SMR家族与MATE家族[14]。其中外排作用最强的是RND家族，目前认为该家族只存在于革兰阴性菌中[15]。2000年首先发现了hefABC、hefDEF和hefGHI 3种RND外排泵系统，研究得最多的为hefABC-RND外排泵系统[16]。

2.2 HP相关外排泵系统的特点 HP相关外排泵系统的特点是由转位酶、TolC同源基因和跨膜连接其他2种组分的附属组件组成。其中最具特色的是HP0605-HP0607转运体，也被称为hefABC或Acra/B/TolC系统。已有研究表明，HP菌株中存在大量hefA外排泵基因，且其与HP的多重耐药关系密切[17]。治疗HP的一些常用抗生素如阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和四环素的耐药性与外排泵皆有密切关系[18]。对大肠杆菌外排泵的研究表明，革兰阴性菌的RND外排泵大多属于TolCAcrAB和OprM-MexAB系统[19]，RND家族在HP的多药耐药中发挥着重要作用。Kutschke等[20]分别测定了野生菌株和基因突变菌株种12种抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，发现基因突变菌株中有超过一半抗生素的MIC出现了下降，推测细菌耐药性与外排泵之间存在着一定关系。该研究还表明，敲除HEFC基因可增加青霉素、头孢噻肟、红霉素、克拉霉素和四环素等对HP的有效性[21]。外排泵与HP生物膜的形成也有一定关系。有研究表明，相比于浮游菌株，有生物膜形成的菌株外排泵基因明显高表达，推测生物膜可能与外排泵系统共同发挥作用增加抗生素耐药性。临床多药耐药的HP菌株中，外排泵基因的表达水平高于该菌的敏感菌株，表明转运蛋白的产生与耐药表型有直接关系[22]。也有研究表明，SpoT基因作为一种HP生长的潜在转录调节因子，其在球形HP中具有较高水平的表达，敲除外排泵Glup增加了HP对抗生素的敏感性[23]。此外，外排泵基因HP0605、HP0971、HP1327在有生物膜形成的菌株中的表达显著高于浮游菌株，表明外排泵和生物膜可以通过协同作用增加抗生素耐药性[21]。

3 外排泵与HP抗生素耐药性的关系

3.1 外排泵与克拉霉素 克拉霉素是一种大环内酯类抗生素，其耐药性通常由23SrRNA点突变引起，HP对克拉霉素的耐药率已达20%～50%[5]。克拉霉素耐药性与外排泵系统紧密相关，KefB参与了HP对克拉霉素的耐药[24]。Zhong等[25]的研究进一步表明，在MIC剂量克拉霉素的刺激下，外排泵基因在HP1870中表达显著，而在标准菌株中表达不显著，说明HP耐药菌株中外排泵基因发挥着重要作用。此外，在突变型菌株中RND家族的基因突变率明显高于野生型菌株的基因突变率[26]。安莹[27]通过敲除hefABC、hefDEF、hefGIH等外排泵基因研究其与克拉霉素耐药的关系，发现基因敲除后的MIC显著低于野生菌株，表明hef外排泵系统在克拉霉素耐药中发挥重要作用。

3.2 外排泵与甲硝唑 甲硝唑的细菌耐药性主要是由基因突变引起。但也有研究发现，hefA基因的过表达可减少甲硝唑在HP中的含量，推测hefA可能与甲硝唑耐药有关[28]。TolC同源基因对外排泵活性的上调至关重要，该同源基因过表达与甲硝唑的浓度有关，且呈正相关，通过增加药物的排出，从而导致甲硝唑耐药，这可能是甲硝唑耐药的关键[29]。

3.3 外排泵与左氧氟沙星 左氧氟沙星三联或四联疗法为临床治疗HP感染提供了明显的优势，但氟喹诺酮类药物的滥用，使得HP对左氧氟沙星耐药的发生率增加。大多数左氧氟沙星耐药HP的克隆已被确定与gyrA的Ala88、Ala97和Met191位，以及gyrB的Phe438、Glu463、Asp481和Arg484位的突变有关[30]。此外，革兰阴性细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性是通过主动排出抗生素获得的，在大肠杆菌分离菌株中，外排泵基因表达的抑制降低了氟喹诺酮类药物的MIC。Ye等[31]通过Sanger测序推测HP0970(hefE)和HP1329(hefI)中的12种突变可能会降低对左氧氟沙星的耐药性。

3.4 外排泵与四环素 四环素是一种杀菌性的抗生素，四环素的耐药性主要是由于其在16 S核糖体RNA初级结合位点上的碱基发生替换所致。事实上，导致四环素耐药的另外一个重要因素也可能与外排泵的介导有关。有研究发现，由于hefAB外排泵的介导参与，四环素的杀菌效果会发生一定程度的降低。还有研究发现，四环素的耐药性可能还与依赖质子动力的外排机制有一定关系[28]。此外，某些外排泵基因如HP1165和 hefA的过表达，也会加强HP对四环素的耐药性[32]。

4 HP外排泵抑制剂

目前发现的外排泵抑制剂主要是通过抑制细菌对药物的排出，从而恢复耐药性细菌对抗生素的敏感性，其作用机制主要归为以下3点：(1)干扰外排泵的组成；(2)阻断外排泵能量供给；(3)干扰底物通过外排泵[33]。羰基氰氯苯是一种通过质子驱动的解偶联剂，主要是通过抑制外排泵系统的动力，使其恢复细菌对抗生素的应答从而发挥作用。二胺类化合物(PAbN)是一种RND型外排泵抑制剂，可能是通过第3类机制，来达到恢复细菌对多种抗生素的敏感从而发挥作用。Hirata等[34]报道PAbN能降低克拉霉素耐药菌株中的MIC，且随着PAbN剂量的增加，克拉霉素的MIC表现出依赖性降低，表明外排泵与克拉霉素的耐药性存在一定联系。质子泵抑制剂(PPIs)作为一种质子动力解偶联剂，被广泛用来抗HP感染，也是通过阻断外排泵能量供给来恢复细菌对抗生素的应答。郑鹏远等[33]研究指出，泮托拉唑浓度为10 μg/ml时可显著降低耐药菌株对四环素、克林霉素等的MIC，同时可以增加敏感菌株对部分抗生素如琥乙红霉素和头孢曲松的敏感性，表明PPIs在HP根治中可能通过抑制外排泵的排出能力，从而提高杀菌力。此外有研究表明，在常用的PPIs中，雷贝拉唑对耐药菌株体外实验的影响最大，其次是泮托拉唑，说明雷贝拉唑能更好地抑制外排泵和逆抗药性[35]。但国内外将PPIs作为外排泵抑制剂的研究还比较少，有待进一步探讨。

5 小结与展望

HP耐药率持续上升，且出现多药耐药菌株，外排泵与HP多重耐药性有着密不可分的关系。外排泵抑制剂可以通过抑制细菌对药物的排出，达到降低某些抗生素MIC的作用。对HP外排泵进行研究，一方面可以在基因水平上抑制蛋白质的过表达，另一方面可以开发出有效的外排泵抑制剂，这对解决HP抗生素耐药性提供了新思路。目前国内外对外排泵系统及外排泵抑制剂与HP抗生素耐药性的研究还值得进一步探索，以帮助临床实施更规范、更精准的治疗，控制耐药菌株的形成和播散，进而提高HP的根除率。