中性粒细胞胞外诱捕网在急性缺血性脑卒中的研究进展

徐跃轩 赵晓丽

急性缺血性脑卒中又称急性脑梗死，是指各种脑血管病变所致脑部血液供应障碍，导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。据全球疾病 负 担 2017（Global Burden of Diseases2017，GBD2017）显示，缺血性脑卒中是世界范围内死亡和永久性残疾的主要原因之一［1］。在美国，每年有近70 万人经历新发或复发性缺血性卒中，有3%的美国人口受到卒中的影响，卒中已成为美国第五大死亡原因［2］。我国住院急性缺血性脑卒中患者发病后3 个月时病死率9%～9.6%，致死/残疾率为34.5%～37.1%［3］。最近有研究发现活化的中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）可以捕获微生物以阻止其传播，并可以保持局部高浓度的抗菌药物以降解毒素、杀灭细菌［4］。但近来有研究证实NETs 与急性缺血性脑卒中的发生发展有关［5］。本文将围绕NETs的形成及其在急性缺血性脑卒中的意义进行概述。

1 NETs 概述

1.1 NETs 的发现及构成

2004 年Brinkmann 等［4］人首次发现了活化的中性粒细胞会向胞外释放一种由解聚的DNA 及多种颗粒蛋白组成的纤维网状结构，即NETs。NETs 的主要成分为DNA，主要蛋白质成分为组蛋白（Histone，H），主要是组蛋白H2A，H2B，H3 和H4，其他蛋白质成分包括中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、乳铁蛋白、凝胶酶、防御素、钙卫蛋白和抗菌肽等［4］。

1.2 NETs 的形成机制

Brinkmann 等［4］人发现NETs 在中性粒细胞激活后10 分钟形成，其进程早于细胞凋亡。Fuchs 等人认为NETs 形成不同于细胞凋亡和坏死，是一种新的中性粒细胞的死亡方式［6］。研究表明，诱导NETs 形成的因素诸多，如细菌、病毒、真菌、白介素-8、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、自身抗体、佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA）等均可诱导NETs 形成。

近年来的研究证实，不同的诱导因素所介导的NETs 形成方式也有所不同。其中最为经典且研究最为详细的为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依赖性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）途径。Fuchs 等人证实了NETs 形成依赖于NADPH 产生的ROS［6］。在PMA 或者LPS 等刺激因素作用下，在NADPH 酶生成的ROS 和钙离子的作用下，蛋白精氨酸去亚胺酶4（Peptidylarginine deiminase 4，PAD4）诱导中性粒细胞的组蛋白H3瓜氨酸化及染色质结构改变，导致染色质去聚化，ROS 作为第二信使作用于MPO 和NE 从胞质颗粒迁移到细胞核内，增强染色质去聚化及促使核膜破裂，进而导致中性粒细胞释放解聚的核DNA 及相关颗粒蛋白组成NETs［7-9］。同时，Li 等［8］人的研究表明PAD4 的活性对于NETs 的形成也至关重要［9］。Hakkim 等人证实Raf-MEK-ERK 通路位于NADPH 氧化酶的上游，参与了NETs 的形成。Kang 等［10］人证实了银纳米粒子（AgNPs）也是通过NADPH 依赖ROS 途径诱导NETs 形成。

其他诱导途径如金黄色葡萄球菌可以激活Toll 样受体2（Toll like receptor 2，TLR2）及补体途径诱导NETs 形成，但需要TLR2 和补体同时存在，单独的TLR2 或补体存在均不能诱导NETs 形成［11］。金黄色葡萄球菌还可以通过一些成孔毒素如γ 溶血素在中性粒细胞核膜上形成孔，诱导组蛋白、含有MPO 和NE 的颗粒蛋白释放到胞外来刺激NETs 形成［12］。除此之外，肌动蛋白骨架重排、梗死灶周围的酸碱环境、氧浓度和铁离子也可能影响NET 的形成［5，13］。

1.3 NETs 的检测

NETs 的结构比较复杂，至今尚未统一检测指标及方法，但在近些年的研究中，瓜氨酸组蛋白H3（Citrullinated histone H3，citH3）被 普 遍 用 于NETs 的检测，通常用citH3 的含量代表NETs 的含量［14-15］。除此以外，由中性粒细胞产生的游离胞外DNA（Cell-free DNA，cfDNA）作为NETs 的主要成分也常用于NETs 的检测，而NE、MPO 等NETs 的蛋白组分也被广泛应用于NETs 的双通道检测。

2 NETs 的分类

根据中性粒细胞的形态变化，NETs 可分为三种类型：①suicidal NETosis：由细胞溶解性死亡释放NETs，细菌、真菌、病毒、PMA、白介素-8 等诱导中性粒细胞通过NADPH 依赖性ROS 途径释放解聚的核DNA 及相关颗粒蛋白组成的NETs，通常在2～20 小时内发生；②Vital NETs：由活细胞将NETs通过囊泡运输的方式释放至胞外，金黄色葡萄球菌诱导中性粒细胞通过依赖TLR2 途径释放核DNA等组成的NETs，通常在10～60 分钟内发生；③mitochondrial NETs：由活细胞释放的NETs，经过粒-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）预处理，中性粒细胞在LPS 或补体因子5a 刺激下释放由线粒体DNA组成的NETs，通常在15～20 分钟内发生［16］。

3 NETs 在急性缺血性脑卒发生中的作用

依据局部脑组织发生缺血坏死的机制可将缺血性脑卒中分为三种主要病理生理学类型：脑血栓形成（Cerebral thrombosis）、脑栓塞（Cerebral embolism）和血流动力学机制所致的缺血性脑卒中。脑血栓形成和脑栓塞均是由于脑供血动脉急性闭塞或严重狭窄所致，约占全部急性脑梗死的80%～90%。最近，大量的研究发现NETs 与脑血栓形成有关［5，17］。

3.1 NETs 在动脉粥样硬化中的作用

动脉粥样硬化是缺血性脑卒中的常见病因，其随着年龄的增长而加重，高龄、高血压病、高脂血症、吸烟、糖尿病是其重要的危险因素。近年来，有研究证实NETs 可以促进动脉粥样硬化的发展。NETs 形成后反馈诱导DNase 反应，这也是NETs 清除的重要机制。Dhawan 等［18人发现高固醇血症会损害Apoe-/-小鼠的DNase 反应，导致NETs 清除延迟并加重炎症，通过外源性补充DNase1 清除NETs 后，炎症减轻并出现了有益的动脉粥样硬化斑块重塑］，这表明了调节NETs 在体内的水平可能成为延缓或阻止动脉粥样硬化进展的治疗手段。

3.2 NETs 在脑血栓形成中的作用

血栓形成是在某些诱导因素下血液中的有形成分聚集，形成固体质块的过程。近年来大量的研究证实NETs 在血栓形成部位存在，为血栓的组分之一［19-20］。

2017 年Laridan 等［19］人采用免疫组化及免疫荧光染色法首次证实了缺血性脑卒中的血栓中存在NETs，且其为缺血性脑卒中的血栓的共同组分。2018 年Ducroux 等［20］的研究表明，所有急性缺血性脑卒中的血栓均含有NETs，且NETs 主要位于血栓的外层。2020 年Novotny 等［21］人的研究也证实了急性缺血性脑卒中的血栓中百分百含有NETs。2022 年Li 等［5］人的研究表明中性粒细胞和NETs 存在于缺血损伤后梗死灶同侧的血管周围，在缺血后1～3 天达到峰值。基于这些发现，目前关于急性缺血性脑卒中的研究方向和研究热点有所转移，如NETs 如何影响血栓形成。

大量的研究证实NETs 通过以下途径促进血栓形成：①NETs 对内皮细胞具有细胞毒性，并与血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）等共同促进高凝状态［22］；②NETs 为血小板、红细胞和促凝剂分子提供骨骼支持，以促进血栓形成［23］；③NETs 中包含的蛋白质成分激活内源性凝血途径，如血小板可以增强中性粒细胞释放NETs，在组蛋白等的作用下，诱导凝血因子FXII（Coagulation factor FXII，FXIIa）依赖性凝血，进而促进血液的高凝状态［22，24］。组蛋白释放到循环后，还可以在凝血因子FXIII（Coagulation factor FXIII，FXIIIa）等的作用下与纤维蛋白交联，促进凝血和增加凝块的稳定性，导致动脉、静脉和微血管血栓形成［25］。

4 NETs 在急性缺血性脑卒中预后中的作用

2017 年Vallés 等人研究表明急性缺血性脑卒中患者的citH3 水平显著升高与下列因素相关，如年龄较大、血糖水平升高、房颤史、心栓塞性卒中和卒中严重程度升高［5］。这表明血浆中citH3 水平可能作为脑卒中患者的预后衡量指标，同时也可作为脑卒中患者的评估卒中严重程度的指标。2019 年Lim 等［26］人通过测量急性缺血性脑卒中患者血浆中的双链DNA（dsDNA）和DNA-组蛋白复合物的浓度来评估NETs 的含量，证实了急性缺血性脑卒中患者在初始阶段时NETs 的水平升高。与此同时，Lim 等使用ROC 曲线分析dsDNA 浓度在急性缺血性脑卒中初始阶段是否是有效的标记物，计算得到AUC 值为0.859，即dsDNA 浓度在急性缺血性脑卒中初始阶段是有效的标记物。但此研究存在方法学上的局限性，结论的准确性还需进一步探索。

5 NETs 在急性缺血性脑卒中治疗中的意义

2021 年Genchi 等［27］对80 例缺血性脑卒中患者经血管内机械取栓提取的人脑血栓进行组织学分析，描述了NETs 的组成并采用免疫组化染色法测定了血栓NETs 含量及采用ELISA 法测定了血浆NETs 含量，结果发现量化NETs 可以区分心源性栓塞性卒中和大动脉粥样硬化性卒中。此前Laridan 等［19］人的研究中也发现心源性栓塞性卒中的NETs 含量为非心源性栓塞性卒中的两倍。这为临床正确的区分缺血性脑卒中的类型提供了有力的支撑，后续的治疗也将更加具有针对性。但目前的结论大多建立在动物模型之上，进一步的探索将具有重大的临床意义。Dhawan 等［27］人通过外源性补充DNase1 纠正了DNase 反应缺陷的情况也表明了NETs 作为新兴的治疗靶点可能性。

6 总结

从上述的研究和讨论中可以明显看出NETs与血栓形成的关系及其在急性缺血性脑卒中的发生发展中的作用。目前急性缺血性卒中溶栓治疗的成功率较低，更加深入地了解急性缺血性脑卒中的血栓形成就至关重要。此外，关于急性缺血性脑卒中血栓的研究对于脑血栓的靶向治疗的进展也极其重要。

目前关于NETs 的研究报道较少，其在急性缺血性脑卒中发生发展中的作用机制尚未完全阐明，但根据目前的研究成果，NETs 在急性缺血性脑卒中的作用有进一步的临床研究价值，需要深入的探索与研讨。NETs 除了与急性缺血性脑卒中的发生有关，还与其他血栓性疾病、自身免疫性疾病、脓毒血症、肿瘤、牙周炎的发生发展有关。综上所述，更加深入细致地研究NETs 形成的确切机制，以及NETs在疾病发生发展中扮演的角色，对于阐明疾病的发生机制及发现新的诊疗手段具有重要的临床意义。