FLOT1在结直肠癌中的表达及与预后、临床特征关系研究*

郭旭利 郭晓红 杨晓彬 袁乐中 查银莲 易智君

1 广东省惠州市中心人民医院肿瘤内科 516000； 2 惠州市惠城区水口人民医院内科； 3 惠州市中心人民医院病理科

结直肠癌是世界范围内发病率排第4位的肿瘤，发病率及死亡率逐年攀升并严重威胁人类生命，也是导致中国人因癌症死亡的第4大常见原因，也是第3大最频繁诊断的癌症[1]。结直肠癌主要据其临床病理分期判断治疗方案和预后。但发现分期相同的患者生存时间有较大差别，有些术后分期早的患者反而较早出现复发。数据调查显示，10%～20%的Ⅱ期和30%～40%的Ⅲ期结直肠癌患者在治疗后复发，而有关结直肠癌发生发展及预后的研究仍较少[2]。FLOT1在多种恶性肿瘤中有异常表达，对治疗方案、生存预后有指导意义[3]。FLOT1在结直肠癌中的表达特征及对结直肠癌预后的影响不明确，寻找与结直肠癌发展及预后相关的肿瘤标志物有利于分析肠癌的发病原因，指导制定治疗方案及患者预后的评估。本研究使用RT-qPCR法研究FLOT1在结直肠癌及癌旁组织中表达的差异，旨在为临床提供理论参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2019年1月—2020年12月收治的经病理结果证实的50例结直肠癌患者进行研究，经医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。所有患者中，男28例，女22例；年龄40～78岁，平均年龄(62.03±1.47)岁。所有标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，制成4μm厚切片备染。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-qPCR法：提取总RNA并定量，反转录为cDNA。linc RNA FLOT1引物，上游5’-CACTGGGGAACTCTGACTCC-3’，下游5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’；GAPDH引物，上游5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。PCR反应试剂：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNas-e H Plus)，Ta Ka Ra Code：DRR420A去1μl的2×Prime STAR Max Premix，0.4μl的sense primer，0.4μl的anti-sense primer ，加灭菌蒸馏水至20μl，混合后离心。PCR反应体系，95℃下孵育30s，60℃下孵育20s，共进行40次循环反应；然后72℃下孵育20s，95℃下孵育15s后停止，使用荧光定量PCR方式处理试验数据。

1.2.2 石蜡包埋组织免疫组化法：所采用的试剂Flotillin-1多克隆抗体购自Proteintech公司，枸橼酸盐抗原修复液(pH6.0)、DAB显色液及PBS缓冲液均购自迈新公司。每个组织切片经脱蜡、枸橼酸盐抗原修复液热修复，过氧化氢、牛奶封闭后滴加一抗(1∶200)4℃过夜。复温后滴加二抗，37℃孵育10min，滴加HRP标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育3min，最后DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。

2 结果

2.1 癌组织和邻近的非癌组织中FLOT1 mRNA、FLOT1表达比较 结直肠癌组织FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表达占比高于非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织和邻近的非癌组织中FLOT1mRNA、FLOT1表达比较

2.2 结直肠癌组织中FLOT1的表达与临床病理特征的关系 浸润程度、淋巴结转移、远处转移、临床分期与FLOT1表达密切相关。见表2。

表2 结直肠癌组织中FLOT1的表达与临床病理特征的关系

2.3 结直肠癌组织预后的影响因素 Logistic多因素回归分析，FLOT1蛋白是结直肠癌患者的预后独立影响因素(P<0.01)。见表3。

表3 结直肠癌组织预后的影响因素

3 讨论

结直肠癌的分子标志物成为热点，目前已有一些相关分子标志物被发现，但往往特异性较差，临床应用价值相对较低。发现有效的结直肠癌分子标志物并将其作为诊断和预测疾病的依据，为患者提供合理有效的治疗方案尤其重要[4]。因此，寻找特异性较好、临床应用价值较高的分子标志物成为热点。

诸多研究表明，脂质筏的蛋白质标记物参与人类癌症各种各样的生物学过程。Flotillin脂质筏家族成员FLOT1编码一种Caveolae相关的完整膜蛋白，参与囊泡转运和信号转导[5]。既往研究曾对转移性结肠癌细胞株SW620及原位结肠癌细胞株SW480外显子蛋白谱进行对比分析，发现脂筏蛋白FLOT1在SW620中表达显著升高[6]。最近，FLOT1在上皮源性癌中意外被发现，包括乳腺癌和食管鳞状细胞癌等[7]。在肝癌细胞系中FLOT1在mRNA水平和蛋白质水平表达均升高。FLOT1的异位表达促进了食管鳞癌细胞系的增殖，而在体外和体内，沉默FLOT1可抑制乳腺癌细胞的增殖和致瘤性[8]。这些发现表明，FLOT1在上皮起源的肿瘤发生和发展中起着主导的积极作用，但是否也在人类结直肠癌中表达仍不清楚。本研究结果显示，结直肠癌组织FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表达占比高于非癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)，说明了结直肠癌患者存在FLOT1高表达的情况。进一步分析结直肠癌预后的影响因素，结果显示FLOT1是影响预后的独立危险因素(P<0.01)，表明了FLOT1的表达，与结直肠癌患者的预后密切相关，临床需加强对FLOT1表达的检测，以此为临床提供理论指导。

综上所述，FLOT1在结直肠癌组织中存在高表达的现象，且与患者的预后及生存有明显的相关性，可作为未来肿瘤分子生物标记物使用。