实验小鼠与人体内寄生华支睾吸虫成虫的对比研究*

刘 柳 张凤玉 张 静 张 浩

(齐齐哈尔医学院病原生物实验室，齐齐哈尔 161006)

华支睾吸虫(Clonorchissinensis)是我国重要的食源性寄生虫之一，在我国分布广泛。黑龙江省位于中国东北部，有黑龙江、松花江、乌苏里江流经，河流湖泊众多，是我国华支睾吸虫病的重要流行区[1]。黑龙江本地曾有多起肝吸虫病暴发的记录，感染病例屡见不鲜[2]。华支睾吸虫自然感染的宿主较多，除人以外，食鱼的鸟类、猫、狗感染较为普遍[3-4]。以往文献中记载构建动物模型常用兔、犬、猫、狸、大鼠等[5]，小鼠作为华支睾吸虫感染的动物模型在国内报道较少[6]，小鼠体内与人体中自然感染的华支睾吸虫的对比尚未见报道。本实验室前期使用昆明小鼠成功构建了动物模型，为验证所获虫体在小鼠体内发育程度，我们将小鼠感染所获成虫标本与本实验室历年收集的人体感染成虫标本加以比较，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1临床标本：来自附属医院肝吸虫患者手术及胆汁引流物中的送检虫体，经鉴定为华支睾吸虫的标本18只。

1.1.2实验动物：健康清洁级昆明小鼠 8只，6～8周龄，体质量20～30 g，SPF 级环境喂养，实验动物由齐齐哈尔医学院动物伦理委员会批准(伦理批准号QMUAECC-2021-100)，并按照齐齐哈尔医学院动物伦理委员会批准方案执行。

1.1.3主要仪器与试剂：OLYMPUS CX31RBSF光学显微镜(Olympus公司)；Leica光学显微镜、Leica体视显微镜(Leica公司)；HH-BLL-500型恒温箱(上海跃进医疗器械厂)；80目标准检验筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司)。胃蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)，醋酸洋红染液(Coolaber公司)。

1.2 方法

1.2.1囊蚴的采集与分离：选取阳性麦穗鱼 Pseudorasbora parva，剪碎并采用人工消化法消化12 h[7]。过筛除渣后用清水洗涤并多次沉淀，直至上清液澄清。在体视显微镜下将华支睾吸虫囊蚴汇聚到一起，并用小吸管吸出后保存在阿氏液(柠檬酸0.5 g、柠檬酸钠8.0 g、葡萄糖20.5 g、氯化钠4.2 g，加水溶解并稀释至1 000 mL)中[7]置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2动物感染：选取8只KM小鼠，抓住小鼠头部及其后背皮肤，使其头、颈和身体呈直线。灌胃针头从小鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食道后将存有囊蚴的阿氏液注射至胃，每只灌胃感染35～40只囊蚴。

1.2.3虫体采集：灌胃感染3周后，隔天收集一次小鼠粪便，采用水洗沉淀法进行检查，直至在粪便沉淀物中发现虫卵。采用脱颈法处死小鼠，分离、取出肝胆管和肝脏。剪开胆管，切开肝叶，双手挤压使虫体由肝胆管流出。将挤压出的虫体连同肝组织放在盛有0.9%氯化钠溶液的培养皿内，沉淀2 h后收集沉积于皿底的虫体。

1.2.4标本制备：获得的虫体由10%甲醛溶液进行压片固定，待虫体形态稳定后，将其保存在10%甲醛溶液中，固定24 h以上。固定后的虫体用流水冲洗过夜，洗去其表面固定液。使用醋酸洋红染 液染色8 h后进行盐酸乙醇分色、梯度乙醇脱水、透明、封片等步骤[8]。

1.2.5观察测量：将制备的人体与小鼠内的华支睾吸虫标本在光学显微镜下进行观察测量。观测指标包括：虫体大小；口、腹吸盘直径；生殖、消化、排泄系统以及虫卵大小等。

1.3 统计学分析

2 结果

实验的8只小鼠均感染成功，感染至第15天时小鼠开始出现精神萎靡，腹部逐渐隆起；感染至第23天时在小鼠粪便中检出虫卵。剖杀后在小鼠肝胆管获取成虫，所获得的虫体呈扁平状，颜色为乳白色半透明，前端狭窄而尖锐，后端较阔而顿。体前端具有口吸盘，体末端具有排泄孔，体中部可见清晰的腹吸盘、子宫、睾丸等内部器官。将虫体固定并进行醋酸洋红染色后，观察发现其各项特征均与文献中记载的华支睾吸虫[9]相符。将其与来自临床的标本观察比较，结果如下。

2.1 形态比较

2.1.1外部形态比较：华支睾吸虫成虫期体形狭长，背腹扁平，前端稍窄，后端钝圆，形态似葵花子，体表无棘。人体内获得的华支睾吸虫较为圆顿(图1A)，而小鼠体内获得的华支睾吸虫较为狭长(图1B)。口吸盘位于体前侧，腹吸盘位于体前约1/4处，口吸盘略大于腹吸盘。

注：A.人体内华支睾吸虫成虫(×10)；B.小鼠华支睾吸虫成虫(×10)Note: A.Adult Clonorchis sinensis in humans (×10)B.Adult Clonorchis sinensis in mice (×10)图1 华支睾吸虫成虫对比图Fig.1 Comparison of Clonorchis sinensis

2.1.2生殖系统：雌雄同体，生殖器官发达。睾丸2个呈多分支状，前后排列于华支睾吸虫体后部，其长度约占虫体总长度的1/ 4；两睾丸各有一条输精管引出前行，两条输精管汇合成储精囊；受精囊位于睾丸前端，呈不规则椭圆形，受精囊上有一条弯曲的劳氏管；卵巢分3叶，位于睾丸与受精囊前侧(图2A～B)。卵巢引出输卵管，通向卵膜及迂回子宫；子宫长而弯曲上至腹吸盘前，通于雌性生殖孔，开口于腹吸盘前侧，通于雌性生殖孔；卵黄腺分布于虫体两侧，可见其中充满卵黄细胞。

2.1.3消化系统：口位于口吸盘中央，由口入为短而圆的咽，咽后通到短细的食道，食道后分为两只肠管。两只肠管延长到体后端，末端为封闭的盲管，不汇合，位于排泄囊两侧(图2C～D)。

2.1.4排泄系统：排泄孔开口于虫体末端，其上端为排泄囊，呈长管状(图2C～D)，排泄物可从其排出体外。

2.1.5虫卵：虫卵充盈在子宫内部，呈卵圆形。上端稍窄且有卵盖，稍隆起，盖周围卵壳增厚形成肩峰，卵后端大而圆，有一似结节状突起(图2E～F，图3)。

注：A.人体内华支睾吸虫卵巢、受精囊(×50);B.小鼠内华支睾吸虫卵巢、受精囊(×50) ;C.人体内华支睾吸虫排泄囊、排泄孔、肠支末端(×50);D.小鼠内华支睾吸虫排泄囊、排泄孔、肠支末端(×50);E.人体内华支睾吸虫子宫内虫卵(×100);F.小鼠内华支睾吸虫子宫内虫卵(×100)Note: A.C.sinensis ovaries and fertilization vesicles in humans (×50);B.mouse C.sinensis ovaries and fertilization vesicles (×50);C.C.sinensis excretory sacs, excretory holes, and end of intestinalbranches in humans (×50)；D.mouse C.sinensis excretory sac,excretory hole, end of intestinal branch(×50); E.C.sinensisendometrium eggs in human (×100);F.mouse C.sinensis endometrium eggs (×100)图2 华支睾吸虫内部结构Fig.2 Internal structure of Clonorchis sinensis

图3 华支睾吸虫子宫内虫卵(×400)Fig.3 Clonorchis sinensis endometrium eggs (×400)

2.2 测量比较

将华支睾吸虫压片至最薄最长状态后进行测量，寄生于人体内的华支睾吸虫成虫长为(21.57±5.68)mm，寄生于小鼠体内的华支睾吸虫成虫长为(10.22±1.57)mm，差异具有统计学意义(F=25.058，P<0.05)，未压片前的华支睾吸虫处于虫体紧缩状态，由于各个虫体的蜷缩程度不同，不利于数据的测量统计，也不利于染色与内部结构的观察，所以将虫体进行压片后进行数据测量。(请讨论压片固定对虫体大小的影响)；寄生于人体内的华支睾吸虫宽为(6.29±1.04)mm，寄生于小鼠体内的华支睾吸虫宽为(3.25±0.14)mm，差异具有统计学意义(F=14.058，P<0.05)。根据数据测量结果(表1)以及SPSS22.0统计软件分析可知，人体及小鼠内寄生的华支睾吸虫大小、口吸盘、腹吸盘、咽、子宫、卵巢、受精囊、睾丸以及虫卵的P值均小于0.05，即可认为人体内和小鼠体内寄生的华支睾吸虫形态存在明显差异。

表1 人体内和小鼠内寄生华支睾吸虫各部位数据比较Table 1 Comparison of data on parasitic of Clonorchissinensis in humans and

3 讨论

肝吸虫病在我国大部分省份都有发生和流行[10]，人体作为华支睾吸虫终宿主感染较为普遍。以往研究中小鼠作为实验动物相关报道较少。小鼠价格低廉，方便饲养，对外部环境适应能力强，本实验通过探究华支睾吸虫在其体内发育的成熟度，来验证小鼠是否适合作为华支睾吸虫的终宿主，对之后华支睾吸虫动物感染模型的建立具有重要意义。

在本次实验研究中，KM小鼠感染至23 d即可在粪便中查到虫卵，与参考文献[11]报道小鼠的粪便查出虫卵时间为25 d相近，也与国外报道[12]小鼠感染过程查出粪便时间为17～30 d基本一致。在实验过程中观察到，自然状态下华支睾吸虫较压完片后的虫体大小存在明显差异。因此在制作华支睾吸虫标本的过程中，用盖玻片轻轻挤压使标本达到最薄最长状态:其一是为了减少压片固定对虫体大小的影响，其二是方便观察虫体的内部结构。分析人体及小鼠体内获得的华支睾吸虫外部形态观察到内部结构的测量结果，两者外部与内部的形态以及虫卵外观基本无差异，与参考文献[13]的研究结果相仿，但两者的各结构测量数据具有统计学差异。其数据统计结果显示，寄生于小鼠体内华支睾吸虫外部与内部结构的测量数据均小于寄生于人体内的华支睾吸虫，这与参考文献[14]描述的动物源的成虫一般都小于人体中寄生的成虫的观点较为统一。有研究结果显示[15-16]，随着小鼠感染时间的延长，虫体各部位的长和宽是逐渐增大的，那么继续延长感染时间，小鼠体内获得的虫体是否会继续增大，人工感染得到的华支睾吸虫子宫内虫卵是否也具有像人体中获得的华支睾吸虫虫卵有感染性，值得我们进一步探究。这将作为下一步研究的工作重点。