补阴益智汤配方颗粒对睡眠剥夺小鼠记忆力及睡眠质量的影响

李克建 李 静 李 红

(1 湖北中医药大学附属湖北省中医院神志病科，武汉，430000； 2 武汉市儿童医院中西结合科，武汉，430015)

睡眠剥夺(Sleep Deprivation，SD)指自身或外部原因所导致睡眠时间被迫减少的一类疾病，可导致患者注意力下降、学习记忆及认知功能障碍、机体免疫力下降等症状[1]。据世界流行病学分析，全球超过三分之一的人口有睡眠障碍及失眠症状，且世界卫生组织指出SD是一个应得到世界重视和解决的公共卫生问题[2]。目前，国内外主要用中枢兴奋性药物和镇静催眠药物治疗SD，但因不良反应大、对神经系统造成不良影响而使这些药物临床应用受限[3]。中医药防治睡眠障碍历史悠久且疗效显著[4]，中医认为阴虚火旺、阴不敛阳、实火扰心等为失眠症主要病机[5]，以清热泻火、滋阴安神的药物治疗失眠已获得一定疗效[6]。中医经验方-补阴益智汤配方颗粒(Buyin Yizhi Tang Dispensing Granule，BYT)由女贞子、墨旱莲、栀子、黄芩、甘草组成，可滋阴凉血、清热除烦、补益肝肾，对肝肾阴虚、心烦不眠等疗效较好。近来研究发现BYT对东莨菪碱所致小鼠记忆损伤有保护作用[7]，基于以上推测BYT亦可能对SD所致学习记忆下降有一定改善作用。因此建立小鼠SD模型，对此进行验证并初步探讨其作用机制，以期为临床合理用药及中医药开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级ICR雄性小鼠4周龄，体质量18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2018-0002。所有小鼠于本院动物房中常规饲养。本试验经本院伦理委员会批准[伦理审批号：IACUC-01(2020317)]，试验动物符合3R原则。

1.1.2 药物 补阴益智汤配方：墨旱莲20 g、女贞子20 g、栀子10 g、黄芩10 g、甘草5 g，药材均购自本地中药房，用8倍体积纯净水浸泡后投入中药药液浓缩机中进行浓缩，至终浓度为2 g/mL；地西泮片(山西昂生药业有限责任公司，生产批号：20180219)。

1.1.3 试剂与仪器 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：T2190，)；5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司，货号：CD-102334-ELA，)；谷氨酸(Glutamate，Glu)ELISA试剂盒(上海羽朵生物科技有限公司，货号：YEF16367，)；蛋白激酶A-催化亚基β(Protein Kinase A-catalytic Subunit Beta，PKA-Cβ)抗体、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP Rresponse Element Binding Protein，CREB)及磷酸化CREB(P-CREB)抗体、原肌球蛋白受体激酶(Tropomyosin Receptor KinaseB，TrkB)抗体、神经细胞凋亡相关通路配体蛋白(Wnt)抗体、β-连环素抗体、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)抗体(美国abcam公司，美国，货号分别为：ab5815、ab32515、ab32096、ab187041、ab109222、ab32572、ab240038)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司，美国，货号：P0768)。手动轮转式切片机(德国Leica公司，德国，型号：RM2125RTS)；光学显微镜(日本尼康公司，日本，型号：SMZ745)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(美国Bio-Rad公司，美国，型号：1659001、Trans-Blot SD)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将60只小鼠用随机数字表法分为正常对照组、模型组、BYT低剂量组(6 g/kg)、BYT中剂量组(12 g/kg)、BYT高剂量组(18 g/kg)、阳性对照组(地西泮0.9 mg/kg)，每组10只。除正常对照组外，其余组小鼠均参照文献[8]建立SD模型：取SD箱，使小鼠在剥夺箱内自由活动、进食和饮水，在靠近鼠笼底部装有一个长方形的金属杆，设置金属杆的拨动间隔为30 s，剥夺90 min，休息15 min；当拨杆从鼠笼的一端匀速移动到另一端时，小鼠需要跨过金属杆才可以继续活动。如果小鼠睡着，金属杆拨动就会对小鼠产生触觉刺激，唤醒小鼠，阻止睡眠，共给予剥夺21 d。21 d后，观察小鼠行为状态，若小鼠出现狂躁及尖叫行为，且毛色枯暗现象表明造模成功。正常对照组在正常条件下持续光照黑暗各12 h模拟正常睡眠。

1.2.2 给药方法 各组均于造模成功后开始给药，BYT参照文献[7]用生理盐水配制成0.6、1.2、1.8 mg/mL的溶液，地西泮参照文献[9]用生理盐水配制成0.09 mg/mL溶液，均按10 mL/kg的剂量灌胃给药，正常对照组及模型组等剂量灌胃生理盐水。连续给药21 d，1次/d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 小鼠一般行为观察 各组小鼠给药期间，每日观察并记录包括毛发、精神、饮食在内的一般状态。

1.2.3.2 Morris水迷宫实验 各组小鼠末次灌胃给药结束后30 min，参照文献[10]进行Morris水迷宫实验。具体操作方法为：设置水迷宫直径1 m，平台直径9 cm，水温保持23 ℃。训练阶段，把小鼠面朝池壁随机从4个象限放入水中，让其自由游泳60 s，找到平台停留20 s，记录小鼠找到并爬上平台的时间即为逃逸潜伏期；如果小鼠在60 s内未找到平台，则由实验人员引导其找到平台，在平台停留20 s，逃逸潜伏期记为60 s。每次训练结束后擦干小鼠，送回鼠笼休息60 s后，进行下一次训练，共训练12次，取9～12次的平均值进行计算。上述训练结束后第2 d进行空间探索测试，具体操作方法为：撤掉平台，从离平台最远点将小鼠放入水池，视频记录小鼠60 s内穿越平台次数。

1.2.3.3 小鼠入睡潜伏期及持续时间检测 各组小鼠在1.2.3.2实验后，经腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，以翻正反射消失和重新出现为标准，记录小鼠入睡潜伏期及持续时间。

1.2.3.4 标本采集 各组小鼠在1.2.3.3检测后，经尾静脉取血3 mL，于3 000 r/min条件下离心5 min(离心半径为5 cm)后取血清，置于-20 ℃条件下保存备用。立即断头处死小鼠，解剖取小鼠海马组织，剪取0.5 g海马组织置于-80 ℃冰箱保存，剩余海马组织迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h备用。

1.2.3.5 TUNEL染色观察海马组织神经细胞凋亡情况 取1.2.3.4项下4%多聚甲醛溶液中固定24 h的海马组织，经脱水、透明、石蜡包埋后切成4 μm切片，并经脱蜡、脱水、3%H2O2灭活，胃蛋白酶K孵育后添加TUNEL工作液37 ℃下湿盒中孵育1 h，随后封闭滴加转化剂-POD 50 μL/片，置37 ℃下湿盒中孵育10 min，0.01MPBS洗涤后滴加二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)底物孵育15 min后苏木精复染50 s后常规脱水、透明、封片。在共聚焦显微镜下观察切片中神经细胞凋亡情况(细胞核染成棕褐色颗粒者为凋亡细胞)，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3.6 血清5-HT及Glu水平检测 取1.2.3.4项下-20 ℃冰箱保存的血清标本，4 ℃条件下解冻后，按ELISA试剂盒说明书方法检测血清5-HT及Glu水平。

1.2.3.7 蛋白质免疫印迹法检测海马组织PKA-Cβ、P-CREB、CREB、Trk B、Wnt、β-连环素、β-gal蛋白相对表达水平 取1.2.3.3中-80 ℃保存的海马组织，匀浆后取上清液，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)试剂盒检测蛋白总浓度。取50 μg蛋白上样，进行电泳和转膜反应，洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗[PKA-Cβ、P-CREB、CREB、Trk B、Wnt、β-连环素、β-gal、β-肌动蛋白(内参)]抗体，稀释倍数除内参抗体为1∶2 000外，其余均为1∶1 000，4 ℃摇床室温孵育过夜，TBST振洗后加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)羊抗兔二抗(稀释倍数1∶2 000)，37 ℃摇床室温孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态 正常对照组小鼠行为活动正常，毛色光泽柔顺；与正常对照组比较，模型组小鼠摄食量减少，毛发脏乱无光泽，精神萎靡，活动减少，反应迟钝，抓取时出现尖叫、狂躁行为；与模型组比较，BYT各剂量组饮食正常，活动增多，抓取时尖叫、狂躁行为减少。

2.2 各组小鼠Morris水迷宫实验逃逸潜伏期、穿越平台次数比较 与正常对照组比较，模型组小鼠逃逸潜伏期增加，穿越平台次数减少，学习记忆能力降低(P<0.05)；与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组小鼠学习记忆能力升高(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组比较学习记忆能力差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠Morris水迷宫实验逃逸潜伏期、穿越平台次数比较

2.3 各组小鼠入睡潜伏期及持续时间比较 与正常对照组比较，模型组小鼠入睡潜伏期增加，睡眠持续时间减少，睡眠质量降低(P<0.05)；与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组睡眠质量升高(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组比较睡眠质量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠入睡潜伏期及持续时间比较

2.4 各组小鼠血清5-HT及Glu等神经递质水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠血清Glu水平增加，5-HT水平减少，神经递质水平异常(P<0.05)；与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组小鼠神经递质水平趋于正常(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组神经递质水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血清5-HT及Glu等神经递质水平比较

2.5 各组小鼠海马神经细胞凋亡率比较 海马神经细胞被染成棕褐色的为凋亡细胞，正常对照组小鼠海马神经细胞染色正常。与正常对照组比较，模型组小鼠海马神经细胞核固缩且染色较深，神经细胞凋亡率增高(P<0.05)，与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组小鼠细胞核染色较浅，神经细胞凋亡率降低(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组比较海马神经细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表4。

图1 各组小鼠海马组织(TUNEL染色，×400)

表4 各组小鼠海马神经细胞凋亡率比较

2.6 各组小鼠海马组织PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组小鼠海马组织PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表达减少(P<0.05)；与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组小鼠海马组织PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表达升高(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组比较PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表5。

图2 各组小鼠海马组织PKA-Cβ、P-CREB/CREB、TrkB蛋白表达免疫印迹图

表5 各组小鼠海马组织PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表达比较

2.7 各组小鼠海马组织Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组小鼠海马组织Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达减少(P<0.05)；与模型组比较，BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组小鼠海马组织Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达升高(P<0.05)，BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性对照组比较Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3，表6。

图3 各组小鼠海马组织Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达免疫印迹图

表6 各组小鼠海马组织Wnt、β-连环素、β-gal蛋白表达比较

3 讨论

睡眠可缓解疲劳、巩固和改善学习记忆、提高机体免疫力[11]。刘陶等[8]发现，SD 3周可造成小鼠学习过程减慢及空间记忆能力受损。为模拟人类长期睡眠不足模型，本研究用SD箱给予小鼠3周SD，发现模型组小鼠活动减少、反应迟钝且狂躁，学习记忆能力下降，提示SD3周后，小鼠学习过程减慢及空间记忆能力受损，表明造模成功。海马与学习记忆有关，对睡眠丧失特别敏感，若海马体受到大范围损伤，会引起记忆丧失[12]。本研究发现SD模型小鼠海马组织神经细胞凋亡率高于正常对照组，可能与学习记忆功能下降关系密切。另外，学习记忆功能维持离不开中枢神经系统递质的参与。兴奋性神经递质Glu不仅参与学习记忆传导过程[13]，还参与睡眠觉醒、总睡眠时间与慢波睡眠的维持过程[14]；5-HT水平增高或降低均会损害学习记忆活动[15]，且5-HT参与非快速眼动睡眠的维持过程[16]。本研究发现SD小鼠血清Glu水平及入睡潜伏期升高，5-HT水平及睡眠维持时间降低，预示SD小鼠神经递质释放异常、睡眠质量较差可能与学习记忆力下降关系密切。

中医将睡眠障碍归属为“不寐”“不得眠”，认为“寐本乎阴，神其主也，神安则寐，神不安则不寐”[17]，并认为“心藏神，脑为元神之腑”“人之记忆，皆在脑中，小儿善忘者，脑未满也；老人健忘者，脑渐空也”提示心神与脑神息息相关，“一处神明伤，两处皆伤”暗示睡眠不足心主血脉功能不调，会累及脑功能及记忆受损[17]。火热之邪、上扰心神为失眠的病因，中医验方BYT中女贞子可去燥火，现代药理发现其可用于治疗神经炎、神经衰弱等症[18]；墨旱莲可滋补肝肾、凉血止血，与女贞子合用其滋阴效果较好，治疗肝肾阴虚火旺症；栀子可清热泻火、凉血、除烦而治疗火热上炎虚烦不眠；黄芩清热燥湿，泻火解毒，其善清中上焦湿热除烦渴，为清热佳品，甘草除调和药味外，也可清热解毒，方中诸药配伍可清心、肝、肺、肾脏腑之热，滋阴凉血、降虚火而助眠，且在本科室用于治疗顽固性失眠，并取得较好疗效。本研究发现BYT治疗后，SD小鼠精神萎靡、反应迟钝及狂躁等减轻，空间记忆学习能力提高，海马神经细胞凋亡率、神经递质释放趋于正常，睡眠质量提高，提示BYT可能通过减少海马神经细胞凋亡，调节神经递质释放，来改善SD小鼠学习记忆能力及睡眠质量。这为BYT的开发应用提供了一定参考，但其具体分子生物学机制还不甚清楚，本研究对此进行继续探究。

学习记忆过程中，突触可塑性及学习、记忆相关的PKA-Cβ入核后可使CREB磷酸化，通过与cAMP反应元件结合，调节神经营养因子等多种基因转录和表达，进而调控神经活动的传导、神经细胞及突触的生长、分化、再生及记忆的整合、维持[19]。另外脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)与TrkB结合，可调控突触联系，使获得的记忆片段得以长期储存[20]。本研究中SD小鼠海马组织中PKA-Cβ、P-CREB/CREB、TrkB蛋白表达明显低于正常对照组，预示PKA-Cβ/CREB/TrkB通路的衰减可能与SD小鼠学习记忆下降关系密切。Wnt可介导中枢神经系统海马神经的再生，研究证实Wnt激活后，β-连环素可与转录因子复合体结合，驱动β-gal表达，促进海马新生神经细胞新生并增加其数量，改善动物的学习记忆障碍[21-22]。本研究发现模型组小鼠海马组织中Wnt、β-连环素及β-gal表达明显降低，推测Wnt/β-连环素/β-gal通路抑制可能降低了海马神经新生，可能为SD小鼠学习记忆功能降低的机制之一。而BYT低剂量组、BYT中剂量组、BYT高剂量组及阳性药组小鼠海马组织中学习记忆信号通路PKA-Cβ/CREB/TrkB及海马神经细胞再生信号通路Wnt/β-连环素蛋白表达均明显升高，表明BYT可能通过激活PKA-Cβ/CREB/TrkB信号通路及Wnt/β-连环素/β-gal信号通路蛋白表达，改善SD小鼠学习记忆功能。

综上所述，BYT可调节神经递质释放，改善SD小鼠睡眠质量及学习记忆能力，可能通过激活PKA-Cβ/CREB/TrkB信号通路及Wnt/β-连环素/β-gal信号通路蛋白表达实现。但睡眠不足引起学习记忆损伤机制复杂，可能涉及其他机制共同参与，另外Wnt/β-连环素/β-gal神经细胞新生与学习记忆相关通路之间的联系也需要继续研究。