荧光成像技术用于独活根中香豆素类成分积累规律研究

姬党通 陈玉莹 李 欠

(1 甘肃农业大学农学院，兰州，730070； 2 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，兰州，730070)

独活是伞形科植物重齿毛当归的干燥根[1]，作为一种传统中药材，有着悠久的历史，最早在《神农本草经》中就有记录。独活性温和，味辛辣、苦涩，由于其有效的药用价值，已被列入《中华人民共和国药典》和《欧洲药典》等药典中。具有祛风除湿、散寒止痛的功效，通常主要进入肾经和膀胱经来发挥治疗作用[2-3]。此外，独活还用于保健领域和美容化妆领域。

独活中化学成分复杂。迄今为止，已从独活中分离鉴定出87种化合物，包括香豆素、多烯炔烃、酚酸和甾体等。此外，气相色谱-质谱联用仪分析了近100种挥发油化合物。相关研究报道，香豆素是独活中含量最丰富的化合物，并且是独活中最主要的生物活性成分[4-6]。香豆素类物质最初被用作香料，但在后期的相关研究中发现香豆素类化合物具有抗炎、抗氧化、抗菌以及镇痛等活性作用。其中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯和异欧前胡素已被作为独活质量控制的指标性成分。

药用植物有效成分的积累和形成与其组织器官和部位有着密切的关系。组织化学是在形态学的基础上来研究组织和细胞中的化学组成、分布规律与相对含量变化[7]，利用理化反应来显示植物组织切片中的某种化学成分。组织化学的发展在药用植物有效成分的产生、分布规律及动态变化研究方面具有重要的作用，如对香豆素、挥发油、黄酮以及生物碱等的研究[8-11]。植物组织制片是组织化学研究中重要的环节，制片效果的好坏直接影响组织化学成分定位的准确性，植物组织制片过程常用的技术手段主要有半薄切片、石蜡切片、冰冻切片等。其中冰冻切片技术是在低温条件下将生物组织进行速冻以达到一定硬度并进行切片的一种技术，与其他常规的切片方法相比，具有简便、快速、易操作、对样品破坏小等优点[12-14]。本研究通过优化独活冰冻切片条件，得出药材独活的最佳制片方法。

荧光成像技术是指以特定波长的入射光激发照射物质，通过计算机荧光成像系统获取荧光图像数据[15]，荧光成像技术可以不经过染色处理，就能直接地观察植物组织中自发荧光性成分[16-17]，同时利用荧光强度对植物组织中的有效成分含量进行相对定量分析。有研究者用激光扫描共焦显微镜术(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)研究了不同生长年限、不同部位球花石斛中香豆素类成分的含量及分布特征[18-19]。兰志琼等[20-21]对白芷中香豆素类成分进行组织化学定位研究，确定了香豆素的分布部位。辛华和丁雨龙[22]利用冷冻切片技术和常规石蜡制片技术，采用荧光显微技术对珊瑚菜的根、叶片、叶柄等部位中的香豆素进行了组织化学定位。目前，中药活性成分组织化学研究大多集中在糖类、脂类、蛋白质、挥发油、分泌物等方面，但在药材活性成分的定性与定量研究方面较少。药用植物中有效成分多且复杂，活性成分作为药材中的指标性成分，其产生、分布规律及含量的多少对药材质量品质的评价具有重要意义。因此，本研究运用组织化学的设计思路，采用荧光成像技术对不同生长时期独活根中的香豆素类成分进行定位、定量分析，以此建立独活根中香豆素成分组织化学定位分析方法，为研究独活活性成分的产生、分布、积累规律提供有效的理论依据，为拓宽中药的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 电热恒温真空干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司，型号：DZF-1B)，冷冻切片机(Leica公司，德国，型号：CM1950)，激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss公司，德国，型号：LSCM 800)，正倒置一体荧光显微镜(ECHO公司，美国，型号：BX61+DP70，RVL100-G)；丙三醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20201116)，最优切削温度(Optimal Cutting Temperature Compound，OCT)包埋剂(Leica公司，德国，批号：14020108926)；独活新鲜根取自甘肃省华亭市(165°65′E，35°22′N)，经甘肃农业大学中草药栽培与鉴定系陈垣教授鉴定并确认为伞形科植物独活，试验取材以不同生长期(4、6、8、10、12月)的独活中部新鲜根作为材料。

1.2 独活根冰冻切片的制作

1.2.1 不同保护剂的考察 植物组织冰冻切片过程中，保护剂的使用对植物组织中活性成分的稳定性以及切片的完整性具有重要的作用。目前常用的冷冻切片保护剂有甘油和蔗糖等，保护剂可以和植物组织中的自由水结合，可以降低冰晶对细胞的损伤[23]。同时，部分凝固点较低的固定液也可以起到保护植物组织的作用。实验对不同浓度的甘油和蔗糖溶液作为不同的保护剂进行考察，以筛选出独活根最佳切片条件。见表1。

表1 不同浓度保护剂对独活根冰冻切片质量的影响

1.2.2 不同切片厚度的考察 药材切片厚度直接影响切片质量、切片的难易程度以及观察的清晰度，所以在切片厚度的设置上综合考虑了以上3种因素。通常越薄切片质量越好，但植物组织破碎程度严重，切片过厚影响荧光显微观察的透明度及清晰度。为此，分别对以下3个等级厚度切片进行试验考察。见表2。

表2 不同切片厚度对独活根冰冻切片质量的影响

1.3 香豆素类成分自发荧光组织化学定位研究

1.3.1 香豆素对照试验 取蛇床子素作为对照，配制成10 mg/mL的蛇床子素标准品溶液，置于载玻片上，滴加15%甘油进行封片，制成临时对照品。依据香豆素成分易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂的性质，将切片组织依次通过70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中分别处理30 min，以去除组织中的香豆素类成分。

1.3.2 香豆素自发荧光显微成像定位观察 以优化的最佳切片条件切片后将样品置于荧光显微镜下进行观察，根据香豆素化合物可在最佳激发波长的激光下发出蓝色自发荧光的特性，可在353 nm激发下，发射出荧光的特性，观察独活根中香豆素的自发荧光并拍照。

1.3.3 运用激光扫描共聚焦荧光显微成像技术对不同时期独活中的香豆素类成分进行相对定量分析 试验以采收期的新鲜独活为材料进行预实验，以此筛选得到最佳制片条件。试验选取4、6、8、10、12月等5个不同生长时期的新鲜独活药材作为材料，每个时期随机选取10株，以筛选出的最佳冰冻切片条件分别制备不同时期独活根的组织切片，利用激光扫描共聚焦显微镜在4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino2-phenylindole，DAPI)通道下进行荧光成像观察并拍照，每株药材分别获取10个不同视野下的荧光图像，并记录荧光算术平均强度，做统计学分析处理。

1.4 独活根分泌组织测量统计 运用正置荧光显微镜及成像系统观察组织结构，在相应视野倍数下，利用显微测量技术对不同样品、不同部位处随机选取10个视野统计其分泌组织的个数，并计算其单位面积的密度。此外，结合荧光成像对香豆素类成分集中分布部位的荧光强度进行测算。

荧光强度(FI)=分泌腔密度(个/mm2)×S韧皮部×FI总强度

2 结果

2.1 独活根冰冻切片最佳切片结果

2.1.1 保护剂的选择 研究发现不同种类、不同浓度梯度的保护剂对于独活根冰冻切片的完整性至关重要。同浓度的甘油和蔗糖溶液，浓度大于15%时，随着保护剂浓度的增大，独活根组织难以达到切片的硬度，导致切片困难。浓度小于15%时，随着保护剂浓度的减小，组织切片破碎严重，影响对组织的荧光显微观察。因此，选择以15%甘油作为保护剂处理样品时，得到的切片效果最佳。见图1。

2.1.2 切片厚度的选择 3个等级切片厚度研究发现，当切片厚度大于25 μm时，随切片厚度的增加，虽然组织切片的破碎程度减小，但组织观察透光率减小。当切片厚度≤20 μm，随切片厚度的逐渐减小，切片组织细胞容易破碎，切片难度大。因此，试验选择切片厚度25 μm时，切片效果最佳。见图1。

图1 不同处理方法的独活冰冻切片显微图(×100)

2.2 独活中香豆素成分的分布特征 独活组织切片通过激光扫描共聚焦显微镜，在DAPI通道下可自发产生蓝色荧光。木栓层、栓内层分泌腔、韧皮部分泌道及木质部激发出蓝色荧光，与阳性对照中蛇床子素对照品发出的荧光一致。切片经过乙醇对照组处理后，分泌腔的蓝色荧光消失，木栓层蓝色荧光减弱，而木质部仍有蓝色荧光。表明香豆素成分主要分布在分泌腔、分泌道等分泌组织中。见图2。

图2 独活根显微结构荧光成像图(×100)

2.3 不同时期独活中香豆素成分的荧光成像测定结果 试验选取的5个时期独活香豆素成分的荧光强度测量值如表3所示，利用Sigmaplot 14.0作图软件对不同时期独活总香豆素含量动态趋势变化进行分析。由图3可知，独活根中香豆素类成分总体变化趋势呈“S”形增长模式，不同生长时期对独活香豆素含量变化具有显著影响。在4—10月生长期时段内，随生长期的延后独活根中香豆素含量呈上升趋势，10月香豆素含量达到最大值，荧光强度达1 952.580 6像素荧光强度。4—6月生长期的香豆素含量增幅缓慢，独活营养生长前期地上部分处于快速增长阶段，消耗大量的能量，药材营养物质积累较慢。进入8—10月后香豆素含量增幅较大，独活地上部分生长趋于缓慢、茎叶趋于枯萎，利于根中营养物质的积累。11月之后香豆素含量变化呈下降趋势，独活地上部分的营养转化结束，根系为了维持生命代谢，消耗了部分干物质，根部干物质损耗，不利于独活药材品质的提高。

图3 不同时期独活总香豆素含量变化趋势图

表3 不同时期独活香豆素成分的荧光强度值

2.4 独活根分泌组织系数分析 独活根的不同部位分泌组织及单位密度的显微测量结果如表4～5所示。通过公式计算得韧皮部分泌腔部位香豆素类成分的相对荧光强度为2 443 701.637 1像素荧光强度。

表4 独活根分泌组织测量结果

表5 独活根不同组织部位测量结果(mm)

3 讨论

本研究利用冰冻切片和荧光成像技术对不同时期独活根中的香豆素成分进行定位定量分析研究，首次建立了独活根冰冻切片及荧光成像新方法，通过对保护剂、切片厚度等不同切片条件的筛选，得出药用植物独活根组织制片最佳条件。即独活根经过15%甘油保护剂的处理，切片厚度为25 μm时切片效果最佳。这与川白芷、石斛等药用植物的冰冻切片研究结果具有相同之处，不同之处在于其他研究没有按植物不同时期进行开展试验[24-25]。此外，研究利用显微成像测量技术对不同部位分泌组织进行了统计分析，结合荧光成像对香豆素成分集中分布部位的荧光强度进行测算，发现香豆素类成分主要分布在分泌腔和分泌道中，韧皮部分泌腔部位香豆素类成分的荧光强度为2 443 701.637 1像素荧光强度。本研究建立的方法可在独活组织不经破坏处理的条件下，能简捷、快速地对药用植物中的自发荧光性成分进行原位分析及相对定量研究。

不同时期独活根中香豆素类成分含量变化趋势明显，活性成分积累存在明显差异。本研究同时兼顾组织化学结构和有效成分含量，通过组织切片及荧光成像技术对不同时期独活根中的香豆素类成分进行了定位、定量分析，建立的独活香豆素类成分组织化学定位分析方法，可为研究其他植物中活性成分的产生、分布、积累规律提供有效的理论依据，为拓宽中药的研究提供一定参考。