HLA-DQBI基因多态性与儿童哮喘易感性及糖皮质激素疗效关系研究

郑晓宇，魏兵，廖世峨，张超，刘亚军，朱丽

(1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地；2.北部战区总医院新生儿科，辽宁 沈阳 110016)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以慢性气道炎症为特征的有一定潜在危险的异质性疾病，具有可变性呼气气流受限[1-2]。疾病花销、入院率及死亡率正逐年攀升。儿童哮喘发病与环境、基因及环境与基因间的相互作用有关[3]。

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的基因密集区位于染色体6p21.23，研究表明该处基因可能与哮喘相关表型有关[4],MHC区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点主要位于人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)I类和II类分子上[5]，有助于免疫系统发挥对抗外来入侵的作用。有研究表明[5]123-134HLA-DQ等位基因与哮喘表型间存在关系，DQ异构蛋白在哮喘发病中有重要作用。HLA-DQ与其他基因在儿童肺炎支原体感染相关哮喘中也存在交互作用[6]。HLA-DQB1的多个SNP位点也被证实可能与巴基斯坦旁遮普地区人群哮喘发作有关[7]。

HLA-DQB1 rs1063355位点曾被报道可能与亚洲裔印度人哮喘易感性相关[8]，全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)提示HLA-DQB1基因位点多态性可能与哮喘相关，尚无两个SNP位点多态性与东北地区汉族儿童哮喘易感性间研究。因此，本研究拟通过分析中国东北地区哮喘患儿HLA-DQB1 rs1063355、rs6906021位点SNPs及临床资料，研究其与儿童哮喘发病及吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroids,ICS)疗效间关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

将2016年10月至2020年10月在北部战区总医院诊断哮喘的来自东北地区6～12岁106例汉族儿童纳入病例组，符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[9]诊断标准，排除其中患有先天免疫缺陷病和胃食管反流等会引起儿童反复喘息的其他种类疾病；且入组前未使用过任何抗哮喘治疗药物。其中男57 例，女49 例，平均年龄(8.2±2.0)岁。选取同期就诊的100例来自东北地区汉族健康儿童作为对照组，对照组中男55例，女45例，平均年龄(8.9±2.2)岁，经对比两组在年龄、性别上均无明显差异(t=-2.778，χ2=0.031，P>0.05)，具有可比性。伦理批准号：Y(2020)054号，家属知情同意。对所有病例组儿童根据哮喘严重分级方法及急性发作期临床特征分组。病例组给予吸入用糖皮质激素布地奈德混悬液雾化吸入、每次1 mg、每日2次，逐步减量，并于入组时及入组3个月分别行肺功能检测及C-ACT/ACT量表评估。排除其中因为不良反应(n=2)、失访(n=11)、数据不完整(n=14)等因素的研究对象，共79例符合疗效研究条件。

1.2 基因检测

1.2.1 DNA提取：采集外周血3 mL，置于EDTA抗凝管，经台式离心机Mikro120进行30 min离心处理后留取下层血细胞，试剂盒进行DNA提取，采用HF8/HF16 核酸纯化仪。

1.2.2 引物设计及合成：依次对DNA样本进行电泳、质量检查及浓度评估及稀释。查找GeneBank上发表的关于人HLA-DQBI rs1063355、rs6906021基因部分序列，采用PREMERPLEX2设计引物，由上海生工生物进行引物合成及纯化，设计引物见表1。反应体系共20 μL，组成包含1 × 10X buffer(Takara.)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL 样本DNA和1 μL多重PCR引物。在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，在37 ℃条件下温浴1 h，然后在75 ℃条件下灭活15 min。经过PCR及SNaPshot多重单碱基延伸反应后，向延伸产物中加入1 U SAP酶，在37 ℃条件下温浴1 h，然后经过75 ℃灭活15 min，取0.5 μL延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min。

表1 引物设计

1.2.3 测序

ABI3730XL对产物测序，用 GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)分析原始数据。rs1063355位点荧光吸收峰图如图1所示，rs6906021位点荧光吸收峰图，见图2。

黑色箭头所指即为等位基因位置，从上至下依次为T/T型、T/G型、G/G型

黑色箭头所指即为等位基因位置，从上至下依次为T/T型、T/C型、C/C型

1.2.4 肺常规通气功能测定及C-ACT/ACT评分

德国Jaeger公司Master Screen测试系统在入组时及入组3个月后分别检测肺功能，共检测3次；记录患儿肺常规通气FEF25、FEF50、FEF75绝对值、预计值及其比值，并计算相应指标改善率=[(治疗后数值-入组时数值)/入组时数值]×100%；治疗3个月时做C-ACT或ACT哮喘控制评分，总分≤19分为控制差，≥20分为控制好。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 rs1063355、rs6906021位点基因型及等位基因分布：采用哈迪-温伯格平衡定律检验rs1063355、rs6906021 SNP位点基因型分布，两个位点基因型频率均符合遗传平衡定律(P>0.05)，说明样本群体代表性较好。

2.1.1 rs1063355、rs6906021位点病例组与对照组基因型分布

rs1063355位点野生型为T/T型，变异型为T/G、G/G，对比野生型与变异型在病例组与对照组中的分布情况，未发现存在明显的组间差异(χ2=0.335，P>0.05)；分别将病例组和对照组的野生型T/T与杂合子变异型T/G基因型频率、野生型T/T与纯合子变异型G/G基因型频率比较，无统计学差异(χ2=0.000，χ2=1.580，P>0.05)，见表2。

rs6906021位点野生型T/T，变异型为T/C、C/C，对比野生型与变异型在哮喘组与对照组中的分布情况，发现病例组变异型频率明显高于对照组(χ2=5.293，P<0.05)。将病例组与对照组的野生型与两种变异型基因型频率对比，发现病例组变异型T/C与C/C基因型频率均高于对照组(χ2=4.148，χ2=4.228，P<0.05)，见表2。

表2 病例组与对照组 rs1063355、rs6906021SNPs 基因型分布[n(%)]

2.1.2 rs1063355、rs6906021位点病例组与对照组等位基因分布

rs1063355位点T、G等位基因在病例组与对照组间分布无明显差异(χ2= 2.821，P>0.05)；而rs6906021位点病例组与对照组T、C等位基因频率有差异，病例组C等位基因频率明显高于对照组(χ2=4.611，P<0.05)，见表3。

表3 病例组与对照组 rs1063355、rs6906021SNPs 等位基因分布[n(%)]

2.2 rs1063355、rs6906021位点SNPs与儿童哮喘严重程度关系

rs1063355位点轻度组与中重度组间野生型T/T、变异型(T/G+G/G)频率无明显差异(P>0.05)，T/T与T/G及G/G基因型频率无明显统计学差异(P>0.05)，见表4。rs6906021位点轻度组与中重度组野生型与变异型基因型频率无明显差异(P>0.05)。T/T与T/C、C/C基因型频率对比，无明显差异(P>0.05)，见表4。

表4 轻度组与中重度组 rs1063355、rs6906021 SNPs基因型分布[n(%)]

对比rs1063355位点轻度组与中重度组两种不同等位基因在分布上无明显差异(χ2=0.722，P>0.05)，对比rs6906021轻度组与中重度组两种等位基因型频率亦未发现明显差异(χ2=0.647，P>0.05)，见表5。

表5 轻度组与中重度组 rs1063355、rs6906021SNPs等位基因分布[n(%)]

2.3 rs1063355、rs6906021位点基因型与气道功能指标变化间关系

分析对比气道指标的实测值/预测值比值，FEF25野生型及变异型组改善率分别为(20.83±3.46)%、(18.12±4.36)%，组间差异无统计学意义(t=1.204，P>0.05)。野生型FEF50改善率为(16.09±5.48)%、变异型FEF50改善率为(30.35±9.46)%，野生型FEF75改善率为(25.38±11.26)%、变异型FEF75改善率为(36.83±17.40)%，变异型FEF50及FEF75改善率明显高于野生型(t=-1.845、-0.847，P<0.05)，见图3。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

FEF25、50、75野生型及变异型间改善率未见明显差异(t=1.607、-1.323、-1.941，P>0.05)，其中FEF25野生型、变异型改善率分别为(18.44±5.39)%、(18.15±3.90)%；FEF50野生型、变异型改善率分别为(23.00±7.73)%、(27.96±11.02)%；FEF75野生型、变异型改善率分别为(29.01±9.24)%、(32.23±12.09)%，见图4。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

2.4 rs1063355、rs6906021位点基因型及儿童哮喘控制情况

通过分析rs1063355位点野生型与变异型患儿哮喘控制情况，发现野生型哮喘控制情况优于变异型，但差异不明显(χ2=0.526，P=0.677)，见表6；比较rs6906021位点野生型与变异型哮喘控制情况，发现变异型哮喘控制情况优于野生型，差异亦不明显(χ2=0.130,P=0.757)，见表6。

表6 哮喘控制情况[n(%)]

3 讨 论

HLA基因家族由定位于6号染色体短臂2区 1带的人类主要相容性复合体基因簇编码，总长度达3600 kb[10]。HLA基因家族编码HLA复合体蛋白，参与抗原呈递及免疫反应，与哮喘、过敏性皮炎发病有关[11]。HLA基因以Ⅰ、Ⅲ、Ⅱ类的顺序在染色体上排列，其中Ⅱ类为决定免疫功能的主要区域。主要参与人类机体的免疫应答反应及相应调节，直接间接引起包括哮喘在内的多种免疫性疾病[12-13]。HLA-II类基因主要由 DR、DQ和 DP 3个亚型组成，其中DQ亚型组成之一为DQB1[11]325-339。

DQB1的基因片段覆盖786 bp，参与261个氨基酸的编码合成。Al-Timimi DJ等[14]人发现相对健康人活动性类风湿关节炎患者体内等位基因DQBI×06频率更高，且越严重或活动性越高患者体内该等位基因频率越高。此外，DQB1基因的变异还被发现可能会影响日本脑炎灭活疫苗诱导的中和抗体反应[15]，更加支持其在体内免疫调节中的作用。阿联酋的研究[16]发现DQBI的多个等位基因、基因型及单倍型被证实与1型糖尿病有关，但却未在欧、亚、非人群中确未发现，提示该基因与疾病关系在不同地区及民族中存在差异。

HLA-DQB1多态性与哮喘关系正成为研究热点。1994年意大利Mapp等[17]对二异氰酸诱发的哮喘患者研究发现HLA-DQB1基因多态性与氰酸酯诱发的哮喘相关，韩国研究[18]同样发现HLA-DQB1基因多态性与二异氰酸酯诱发的职业哮喘有关，Lara-marquez ML等[19]针对委内瑞拉人群研究发现，DQB1多态性可能与哮喘易感性相关，Suarez-Pajes E等[20]通过研究证实HLA-DQB1 rs1049213位点变异与哮喘风险显著相关。本研究首次将HLA-DQBI rs6906021位点纳入，检测发现T和C两种等位基因，与现有人类基因库相同，野生型T/T，变异型为T/C、C/C。C等位基因组及携带C等位基因的变异型更易患哮喘，提示该位点可能为中国东北汉族儿童的哮喘易感位点，该位点多态性影响疾病临床表型的机制尚待明确，猜测其多态性可影响与HLA相结合的抗原种类不同发挥作用，进而使递呈至T细胞效率不同[21]，或影响TH1 /TH2细胞免疫反应平衡[22]，直接间接引起哮喘。rs1063355位点位于3’UTR区，有T、G两种等位基因，G等位基因占比较高，构成野生型T/T，变异型T/G、G/G，然而本研究结果提示rs1063355 位点并非中国东北汉族哮喘儿童易感基因位点，然而美国维克森林大学医学院的测序结果[23]却与之相反，分析原因可能与纳入对象的种族及国家不同有关，更证明其多态性研究在哮喘中意义。

ICS作为支气管哮喘缓解期常用药[2]1023-1048，能够缓解气道内炎症及改善肺部气道功能，实现哮喘有效控制，本研究未发现治疗后不同基因型患者C-ACT/ACT评分存在显著差异，但在肺功能指标研究中却发现rs1063355位点变异型FEF50及FEF75实测值占预计值改善率明显高于野生型，作为衡量小气道功能指标的FEF50及FEF75，其实测值占预计值变化率出现基因型差异，提示该位点变异后的治疗效果可能更好，这种变异可能导致了不同基因型间ICS的药效差异，对临床指导用药方面存在一定价值。

现有研究集中于儿童哮喘疾病易感性，且种族、地域及表型异质性相对受限，本研究一定程度填补了空白，对筛选东北汉族儿童哮喘易感基因及临床有一定意义，但不足之处是，需要增加样本量或增加临床指标维度进行研究。