白藜芦醇与维生素E协同抗氧化效应研究

王娜，高恩光，李娜,4，刘情情， 王凡，任红涛，李正邦，余秋颖

(1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450046； 3.郑州市营养与健康食品重点实验室，河南 郑州 450002；4.河南双汇投资发展股份有限公司， 河南 漯河 462000；5.正阳新地花生集团，河南 驻马店 463600)

白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种生物活性很强的天然多酚类物质，广泛存在于多种植物中，在葡萄、虎杖、花生和桑葚中含量丰富[1]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌及保护胃肠道和神经系统等作用，现已被美国、日本、加拿大等国家列为保健品[2-5]。SANTOS等[6]研究发现，白藜芦醇通过调节信号通路降低活性氧水平产生抗氧化效果。吴海峰等[7]研究发现，白藜芦醇具有改善人颗粒细胞氧化应激损伤的作用。维生素E是一种很强的抗氧化剂，具有多种生物活性，体外摄入是其唯一来源，自然界中主要存在于干果和植物油中[8-10]。维生素E同样具有抗氧化、抗炎、神经保护、降低胆固醇和保护肝脏等特性[11-15]。LLORET等[16]研究证明，维生素E有助于保持人类大脑健康。JI等[17]研究发现，维生素E可以降低非酒精性肝炎患者中丙氨酸氨基转移酶水平，临床疗效较好。协同效应是指将多种活性因子联合使用后产生比单一组分更优的功能效果，这种“1+1>2”的现象激起了人们极大的兴趣[18]。饮食对人的健康起决定作用，食物不仅能为人类生命活动提供能量,而且食物中存在的天然活性成分具有特殊的生理功能，对机体健康平衡具有调节功效[19]。食物基质本身十分复杂，其中活性成分的协同效应是非常重要的方面。但是，协同效应的机制研究尚显不足，相关的基础数据比较缺乏，因此已经成为现代营养学的重要研究内容和热点。唐煜括等[20]研究证实了茶多酚与维生素C以特定比例混合后具有协同抗氧化作用。李星亚等[21]证实了茶多糖与茶多酚以一定比例复配具有较好的降血糖协同防治作用。目前，相关研究主要以茶多酚为主，且与其协同物质以维生素C和多糖居多，同时关于白藜芦醇和维生素E的研究均以单一物质研究为主，对两者的联合使用鲜有报道。因此，本研究选用白藜芦醇联合维生素E探讨其体外抗氧化能力的协同效果，为未来聚焦活性营养成分、靶向功能食品的科学合理开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料及试剂 白藜芦醇、维生素E购自北京索莱宝(中国)公司，分析纯；二苯基苦基苯肼(diphenylpicrylhydrazyl，DPPH)检测试剂盒、2,2’-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵(ABTS)检测试剂盒购自南京建成(中国)公司；特丁基对苯二酚(tertiary butyl hydroquinonentrd，TBHQ)购自上海麦克林(中国)公司。双蒸水自制，其他试剂均为市售，分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备 UV-2000紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；DK-600型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；恒温培养箱(日本SANYO公司)；移液枪(德国eppendorf公司)；冷冻离心机(美国Thermo公司)；多功能酶标仪(德国BMG LABTECH公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 体外抗氧化能力评价试验组设计 试验共分为5组，分别为单一使用RES组(白藜芦醇0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)、VE组(维生素E 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)、阳性对照TBHQ组(TBHQ 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)以及联合使用DARV组和ARV组。其中，DARV组是指RES与维生素E按照物质的量1∶1联合后加入溶剂体系，终质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1；ARV组是指DARV组的半剂量组。

1.2.2 不同试验组抗氧化能力指标评价 ①DPPH自由基清除能力的测定。按照DPPH自由基(DPPH·)清除能力试剂盒说明书，测定1.2.1试验组样品DPPH·清除能力。

DPPH·清除率计算公式为：

(1)

式中：D表示DPPH清除率；A2表示样品测定管的吸光度值；A1表示对照管的吸光度值；A0表示空白管的吸光度值。

②ABTS+·清除能力的测定。按照ABTS法试剂盒说明书，测定1.2.1试验组样品ABTS+·清除能力。

ABTS+·清除率计算公式为：

(2)

式中：T表示ABTS+·清除率；A3为空白吸光度(蒸馏水)值；A4表示样品吸光度值。

③还原力的测定。参照AK等[22]的方法，采用铁氰化钾还原法，700 nm处测定1.2.1试验组样品吸光度值。

④铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)测定。参照贾仕杰等[23]和BENZIE等[24]的方法，在1.2.1试验组样品中分别加入FRAP工作液，根据吸光度值大小分析其FRAP值即总抗氧化能力强弱。

1.2.3 不同试验组自由基清除能力评价 为了更好比较不同样品抗氧化活性的强弱，参照艾志录等[25]的方法，根据1.2.1试验组样品对自由基的清除率和质量浓度作剂量效应关系曲线，计算半数清除率IC50值。IC50值越大代表其清除自由基的能力越小。

1.2.4 RES和维生素E联合作用中效原理定量分析 采用中效原理联合作用指数(combination index，CI)，以DPPH·清除率为指标，对RES和维生素E联合作用测得的抗氧化能力进行比较。单一物质的质量浓度选择在线性范围内较低质量浓度(清除率小于30%)，使加和值小于70%[26]。为满足上述复配原则，RES和维生素E按照物质的量1∶1联合后终质量浓度选择0.02、0.04、0.06 g·L-1，体积比例为7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，然后按照1.2.2的方法，测定联合作用的DPPH·清除活性。

CI计算公式如下[27]：

式中：d1为药物1和药物2联合作用抑制率为50%时药物1的作用质量浓度；d2为药物1和药物2联合作用抑制率为50%时药物2的作用质量浓度；Dx,1为药物1单独作用时的作用抑制率为50%时的作用质量浓度；Dx,2为药物2单独作用时的作用抑制率为50%时的作用质量浓度。

计算采用95%置信区间。0.951.05表明药物1和药物2为拮抗作用。

1.2.5 数据分析 试验设3次平行取平均值。利用SPSS Statistics 22.0对数据分析统计、用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 RES和维生素E单一及联合使用体外抗氧化能力比较分析

2.1.1 对DPPH·的清除率比较分析 由图1可知，在一定范围内，不同试验组清除DPPH·呈现一定的量效关系，即随质量浓度增大，对DPPH·的清除效果增加。当质量浓度为0.6 g·L-1，不同试验组对DPPH·清除率都达到90%以上；同质量浓度下RES组的抗氧化活性高于VE组，故在ARV组和DARV组的组合中，RES作为主抗氧化剂发挥作用，维生素E作为辅抗氧化剂发挥作用。当质量浓度小于0.3 g·L-1时，抗氧化物质对DPPH·清除效果为DARV组>TBHQ组>RES组>ARV组>VE组；当质量浓度大于0.3 g·L-1时，DPPH·清除效果为DARV组>TBHQ组>ARV组>RES组>VE组。这可能是因为随着维生素E有效质量浓度的增高，RES和维生素E修复再生，使得ARV组中有效质量浓度得到增加，所以此时ARV组的清除率高于单种样液。

2.1.2 对ABTS+·清除率比较分析 由图2可知，在一定范围内，RES组、ARV组、DARV组和TBHQ组清除ABTS+·的效果都具有剂量效应，且DARV组的清除率高于TBHQ组，最高能够达到90%以上，清除效果最好。在质量浓度低于0.3 g·L-1时，对ABTS+·的清除效果为DARV组>ARV组>RES组>TBHQ组>VE组；在质量浓度高于0.3 g·L-1时，对ABTS+·的清除效果为DARV组>TBHQ组>ARV组>RES组>VE组。RES和维生素E联合使用的DARV组、ARV组的ABTS+·清除率呈现出显著协同作用，DARV组、ARV组的协同作用可能存在1个平衡质量浓度，在一定质量浓度下会具有明显的抗氧化协同增效作用。

图2 RES和维生素E单一及联合使用对 ABTS+·的清除效果Fig.2 Clearance effect of RES and VE alone and in combination on ABTS+·

2.1.3 对还原力比较分析 图3可知，不同试验组均具有一定的还原力，且还原力与其质量浓度呈线性正相关[28]。质量浓度小于0.1 g·L-1时，还原力TBHQ组>DARV组>RES组>ARV组>VE组；质量浓度大于0.1 g·L-1时，DARV组>TBHQ组>ARV组>RES组>VE组。RES和维生素E联合作用的ARV组的还原力呈增长趋势，DARV组的还原力显著提高，可能是因为RES与维生素E联合之后，两者自身的还原作用增强，给出更多电子用于清除自由基。

2.1.4 对总抗氧化能力比较分析 图4可知，质量浓度低于0.5 g·L-1时，TBHQ组>DARV组>RES组>ARV组>VE组，质量浓度大于0.5 g·L-1时，TBHQ组>DARV组>ARV组>RES组>VE组。RES组、VE组、ARV组、DARV组和TBHQ组的FRAP值随着质量浓度的增大，吸光度呈现增长趋势，且DARV组和TBHQ组增长最为迅速，说明质量浓度越高总抗氧化能力越强。这可能与RES和维生素E的结构以及反应机制等因素有关。由于不同抗氧化物质提供氢的羟基位置不同，其活泼程度不同，有效作用于自由基的种类有别，导致各抗氧化剂的性能不同[29]。

虚线表示此质量浓度下样品吸光度值已经超过 线性准确范围，仅以虚线表示趋势。 The red dotted lines indicated that the absorbance value of the sample exceeds the linear accuracy range at this concentration.图3 RES和维生素E单一及联合使用对还原力的作用Fig.3 Clearance effect of RES and VE alone and in combination on eduction capacity

样品质量浓度为0.02、0.04、0.06和0.08 g·L-1时， 总抗氧化能力的吸光度值未有效测出，均记为0。 When the sample mass concentration was less than 0.1 g·L-1, the absorbance value of the total antioxidant capacity of FRAP was not measured and was recorded as 0.图4 RES和维生素E单一及联合使用对 总抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of RES and VE alone and in combination on FRAP value of total antioxidant capacity

2.2 RES和维生素E单一及联合使用自由基清除能力比较分析

根据不同试验组对自由基的清除率和质量浓度作剂量效应关系曲线，计算IC50值并进行比较分析自由基清除能力，结果如表1。DPPH·清除能力为DARV组>TBHQ组>RES组>ARV组>VE组，且RES组、VE组与ARV组、DARV组之间呈现显著性关系, DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低2/3和1/11；ABTS+·清除能力为DARV组>ARV组>RES组>TBHQ组>VE组；还原力大小为TBHQ组>DARV组>RES组>ARV组>VE组，且RES组、VE组、ARV组、DARV组和TBHQ组都具有显著性差异(P<0.05)，DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低5/9和25/32，还原力中DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低1/2和5/18；FRAP值大小为TBHQ组>DARV组>RES组>ARV组>VE组，且DARV组与RES组、VE组、ARV组和TBHQ组具有显著性差异，DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低5/12和10/47。由IC50值可知，RES和维生素E联合后DARV组的IC50值显著降低，抗氧化活性呈现出一定的正协同作用，且联合后其抗氧化能力与人工合成抗氧化剂TBHQ相比效果显著。

表1 RES和维生素E单一及联合使用抗氧化活性IC50值比较Table 1 Comparison of IC50 value of the antioxidant activity of RES and VE alone and in combination g·L-1

2.3 RES与维生素E不同剂量对协同作用的影响

以DPPH的清除率为指标，定量分析RES和维生素E不同体积比例和终质量浓度对协同作用的影响，结果如表2。在RES与维生素E联合终质量浓度为0.02、0.04、0.06 g·L-1时，RES与维生素E的协同效应随着质量浓度的增加而增强；不同质量浓度相同体积比例之间，对DPPH 的清除率差异性显著；V(RES)∶V(维生素E)= 3∶1时，两者的协同效应最强；抗氧化能力为DARV组>ARV组≥RES组>VE组，说明RES作为主剂发挥作用，维生素E作为辅剂发挥作用，并使得DARV组中主-辅剂呈现明显的正协同作用。

2.4 RES与维生素E不同体积比例下协同抗氧化能力的比较

利用中效原理定量分析和IC50值，研究在RES联合维生素E终质量浓度为0.02、0.04、0.06 g·L-1时不同体积比例对协同作用的影响，结果如表3。RES和维生素E体积比例不同其抗氧化效应不同。当V(RES)∶V(维生素E)=1∶2～1∶3，协同氧化能力表现为相加作用(0.95

表2 RES与维生素E体积比例对协同作用影响的研究Table 2 Study on the influence of the ratio of RES and VE on the synergy

续表Continuing table

表3 RES与维生素E不同体积比例对抗氧化 协同作用的影响Table 3 Effect of different ratios of RES and VE on anti-oxidation synergism

3 结论与讨论

白藜芦醇和维生素E作为药食同源食物原料中重要的抗氧化物质，都具有清除体内自由基、抗氧化和抗衰老的功效。本研究发现，在DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、还原力大小和总抗氧化能力能力上，白藜芦醇联合维生素E后均具有显著的协同增效作用，两者的正协同效应与抗氧化物质质量浓度的高低、自身的抗氧化能力呈正相关。其中，在对DPPH·的清除作用上，无论质量浓度高低，二者均有协同增效作用，尤其RES与维生素E按照物质的量1∶1联合后(DARV组)的抗氧化效果最为显著；在ABTS+·清除体系上，RES与维生素E按照物质的量1∶1联合(DARV组)以及DARV组半剂量组(ARV组)均具有显著的协同增效作用，且试验质量浓度范围内，DARV组>ARV组>RES组>VE组；在对还原力进行评价时发现，RES联合生素E作用后ARV组的还原力呈增长趋势，DARV组的还原力显著提高；在总抗氧化能力评价体系中，RES组、VE组、ARV组、DARV组和TBHQ组的FRAP值随着质量浓度的增大，吸光度呈现增长趋势，且DARV组增长最为迅速。白藜芦醇和维生素E联合互作产生的协同效应可能因评价体系不同而产生不同的结果，这是由于不同抗氧化物质提供氢的羟基位置不同，其活泼程度不同，有效作用于自由基的种类有别，各抗氧化剂的性能也不同[29]。

本研究也发现，以半数清除率IC50值作为衡量指标时，在FRAP值和还原力对应的IC50值大小顺序均为TBHQ组>DARV组>RES组>ARV组>VE组，DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低5/12和10/47；DPPH·清除能力对应的IC50值为DARV组>TBHQ组>RES组>ARV组>VE组，DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低2/3和1/11；ABTS+·清除能力对应的IC50值为DARV组>ARV组>RES组>TBHQ组>VE组，DARV组比单一组分RES组和VE组的IC50值分别显著降低5/9和25/32，表明其清除自由基的种类有别；RES与维生素E联合后的IC50值显著小于单一组分(CI<0.95)，表明白藜芦醇和维生素E联合后呈现出协同抗氧化作用，比各组分单一使用时具有更好的抗氧化效果。白藜芦醇是一种多酚类物质，多酚类物质具有两亲性，既溶于水相，也溶于油相，其氧化还原电位介于维生素之间，这种独特的物化性质使多酚与维生素类抗氧化剂之间具有良好的协同效应[30]。RES与维生素E联合之后，两者自身的还原作用增强，给出更多电子用于清除自由基，这也赋予了白藜芦醇和维生素E联合后具有显著的协同增效作用。

本研究利用中效原理定量分析发现，当V(RES)∶V(维生素E)= 1∶1～7∶1之间具有良好的协同效果(CI<0.95)，当V(RES)∶V(维生素E)=3∶1时CI值最小，且此时IC50值也最小，为0.011 g·L-1，故当V(RES)∶V(维生素E)=3∶1时具有最佳的协同抗氧化作用。本研究还发现，同质量浓度下RES组的抗氧化活性高于VE组，故在ARV和DARV的组合中，RES作为主抗氧化剂发挥作用，维生素E作为辅抗氧化剂发挥作用。有研究发现，复合抗氧化剂具有修复再生的作用，辅剂可以再生具有强抗氧化性能的氧化剂，从而表现出抗氧化协同作用[31-32]。在本研究中，DARV组的清除率始终最高，说明RES联合维生素E的清除率效果与样品质量浓度呈正相关。本研究发现白藜芦醇和维生素E联合使用比单一组分有更好的功能效果，具有显著的抗氧化协同增效作用。