基于DNA分子标记的类烟产品鉴别检验抽样方法研究

2022-02-06王春琼张晓伟孙浩巍张冀武童治军盖小雷蔡洁云李海燕

安徽农业科学 2022年24期

张轲，王春琼，张晓伟，孙浩巍，龙杰，张冀武，童治军，盖小雷，蔡洁云，李海燕，陈丹*

(1.云南省烟草质量监督检测站，云南昆明 650106；2.云南省烟草农业科学院，云南昆明 650218；3.云南省烟草烟叶公司，云南昆明 650011)

近年来，除了电子雾化烟和加热不燃烧烟草制品的流行，所谓的“花烟”“茶烟”“药烟”等外形与卷烟相差无几的类烟产品也频繁出现在消费者的视线中，并且已经有未成年人吸食“茶烟”[1]和“药烟”中检出烟碱成分[2]的报道。尽管烟草专卖局、食品药品监督局和市场管理局等部门已加强了对有一定市场空间和回购率且仍处于初期的类烟产品的监管力度，但对于仿冒程度较高的类烟产品，采用现有的方法进行鉴别及判定存在一定的误判风险。因此，探索高效、简便、准确、专属性强的鉴别类烟产品抽样方案和检验方法，对保障真品卷烟的合理流通、烟草专卖和市场监管具有重要意义。

目前，卷烟真伪鉴别检验以感官鉴别法和评吸鉴别法较为常用[3]，而借助电子鼻技术[4]、近红外光谱技术[5]和顶空-气相色谱-质谱[6]等仪器鉴别的方法也正发展成为烟草分析的重要手段，但仍存在一定局限性，如抽样量大、检验费用高，准确、及时鉴别仿冒程度较高的卷烟产品难度大。同时，在现行鉴别检验类烟产品的方法中，主要通过测定样品中烟碱和N-亚硝胺含量，来判定此类产品是否为烟草专卖品。但烟碱并非烟草所独有，很多茄科植物也含有，并且烟草特有N-亚硝胺的含量极低，常出现卷烟样品中检不出烟草特有N-亚硝胺的情况，因此，利用该方法鉴别检验类烟产品存在较大司法风险[7]。DNA标记是指用直接或间接的手段反映研究对象在DNA序列上的差异，即DNA多态性，具有操作简便、样品预处理简单、基本干扰小、样本量少、结果准确、及时等优点，已在司法鉴定[7]、海关检疫[8]、农产品鉴别检验[9]等领域广泛应用。此外，DNA测序技术[10]和环介导等温扩增技术(LAMP)[11]的迅速发展，为利用烟草DNA分子特异标记鉴定检验卷烟产品奠定坚实的理论和技术基础。在抽样方法上，与随机抽样、分层抽样等方法相比，序贯抽样法具有明显优势，即任何一次抽样都可作为终结检验，可大大降低平均样本量、检验成本和时间，此法较为适合取样量少的DNA标记技术[12]。以往鉴别检验卷烟真伪的研究大多集中在感官鉴别法、评吸鉴别法和仪器鉴别法，而关于序贯抽样与DNA标记结合鉴别类烟产品研究鲜有报道。笔者以市场上获得的400支茶烟为材料，研究构建适合类烟产品最小和最大抽样量的序贯抽样检验方案以及DNA检测方法，为科学、准确、高效地鉴别类烟产品提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料该研究的材料来源于市场销售的某品牌规格相同的类烟产品(茶烟)400支；烟支规格为长84 mm，直径7.7 mm。

1.2 方法

抽样特性曲线(OC曲线)是基于抽样方案(ncum，c)绘制的，即从整体为N的产品中抽取样本数量为ncum的样本进行检验，若符合判定标准c，则判定该批产品总体合格，否则判定不合格，通过OC曲线与抽样方案变化的关系可以进一步验证抽样方案的合理性。

1.2.2DNA分子标记鉴别检验类烟产品。为验证抽样方法在检测中的实际效果，将材料中的2条类烟产品破除包装后，将烟支充分混匀，随机抽取52支烟支(类烟产品)为初始样品，以随机抽取的2019年某品牌成品卷烟的标准样品为对照，采用能区分烟与茶的SSR引物，按童治军[14]的方法进行待检样品的基因组DNA提取、纯化及PCR扩增，扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终获得清晰的特异性条带。

2 结果与分析

表1 序贯抽样参考(双尾)Table 1 Reference of sequential sampling (two tail)

2.4 DNA分子标记鉴别验证类烟产品由图2可知，DNA分子标记在卷烟标准样品(S)中250 bp分子量处扩增出特异性条带，而初次抽样的52个类烟产品(n1～n52)均未出现特异性条带，验证了序贯抽样的52个卷烟产品为类烟产品。

图1 序贯抽样ncum为52、110、142和一次抽样n为80、200、400的OC曲线 Fig.1 OC curve (ncum=52，110，142 and n=80，200，400)

注：M为DNA Marker分子量为100～1 500 bp，S为卷烟标准样品扩增结果，n1～n52为初次抽样类烟产品样品1～52扩增结果 Note：M is the DNA marker with molecular weight of 100-1 500 bp，S is the amplification result of cigarette standard sample，n1-n52 is the amplification result of 1 - 52 of the first sample of cigarette-like products图2 初次抽样(nmin=52)烟草SSR特异性引物扩增结果Fig.2 Amplification results of tobacco specificity SSR primer pairs on original sampling (nmin=52)

3 讨论

抽样检验是从一批产品中抽取一些样品进行测量、考核、检验或与规定要求相比，最终依据所得结果决定整批产品或过程是否合格的质量检验方法，目的是在短时间内、以较低的成本、正确地判断产品是否符合技术标准[15]。序贯抽样方法需要每次抽样结束后进行检验，判断是否进行进一步检验，与随机抽样、分层抽样等方法相比，存在一定误判风险，对检验人员的专业技术熟练度要求相对较高[16]。当检验接近判定阈值的批次时，会导致鉴别检验周期延长，需平衡时间和经济成本。在该研究中，无论是卷烟还是类烟产品均属于经工艺和机械加工后的工业产品，其质量有一定的稳定性，也就是说产品的相对一致性是较好的。因此，鉴别检验过程中，烟支含烟草特征性成分的类烟产品数量较少，即混有卷烟的类烟产品在生产过程中被严格控制，大多数的被检样品相对一致性较高，只需检验很小的样本就能通过。从现有的一次抽样方案来看，抽取52支检验，如果假烟大于或等于6支，则该批卷烟判定为不合格，而且以90%的把握认为该批卷烟产品总体卷烟支数比例在区间(6.09%，20.80%)，说明当样本较少时，置信区间过宽，对总体的估计偏差增大，抽样精确度下降，存在抽样取证的“风险”。该研究中的OC曲线也表明，抽样方案在较小抽样量的基础上，随着样品数量的增加比一次抽样具有更佳的灵敏度和确定度。该研究中经过序贯抽样确定nmin为52，此时停止抽取样品进行DNA鉴定，判定52支卷烟均为类烟产品，说明此鉴别方法较为可行。