杭州地区血红蛋白变异体的流行及其对糖化血红蛋白检测系统的影响

吴宣岚 饶舜 吴胜军

浙江大学医学院附属邵逸夫医院钱塘院区检验科，杭州 310018

血红蛋白（Hb）变异体是由位于Hb 的α-、β-、γ-、δ-珠蛋白链上的点突变而引起的Hb 氨基酸序列的改变，其携带者大多不表现出生理功能的改变，但当人体患有复合α 或β 型地中海贫血时，会加重其临床症状，表现为中到重度贫血[1]。由于突变、迁徙、融合与隔离等因素的影响，Hb 变异体存在地域差异，我国长江以南地区变异体携带率明显高于长江以北地区[2-3]。因此对高发地区进行筛查，特别是对我国南方地区Hb 变异体的流行病学研究对于地中海贫血的早期发现和治疗具有重要意义。关于杭州地区Hb 变异体的流行情况，至今鲜有报道。

糖化Hb（HbA1c）是人体血液中葡萄糖与Hb β链N 末端缬氨酸残基以共价键结合形成的稳定化合物，可反映糖尿病患者过去2～3 个月的平均血糖水平[4]。目前临床上常用的HbA1c 检测技术有离子交换高效液相色谱法和毛细管电泳法[5]。前期有研究发现Hb 变异体HbS、HbC、HbE 对离子交换高效液相色谱法HbA1c 检测系统会产生一定干扰[6]，本研究拟通过Hb 电泳技术和基因测序技术，分析本地区主要Hb 变异体流行型别，通过比较分析两种HbA1c 检测系统对Hb 变异体的检测结果，判断检测效能，现报道如下。

材料与方法

一、材料

收集2021年1—8月浙江大学医学院附属邵逸夫医院钱塘院区住院、门诊患者以及健康体检者血液样本5 068 份，分别检测并记录受试者Hb、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白浓度（MCH）、空腹血糖(FPG)和毛细管电泳法HbA1c 结果，并对仪器提示的变异体样本进行Hb 电泳和基因测序确认变异体类型。离子交换高效液相色谱法对变异体样本进行HbA1c 重新检测。本研究经邵逸夫医院伦理委员会审批通过 （伦理审批号： 伦审2022 研第0064 号）。

二、仪器和试剂

血常规检测采用迈瑞BC-6800 全自动血细胞分析仪及配套试剂，血糖检测采用贝克曼AU5831全自动生化分析仪及配套试剂，HbA1c 检测采用毛细管电泳法Sebia Capillary 3 TERA 和离子交换高效液相色谱法TOSOH HLC-723G8 全自动HbA1c分析仪及配套试剂。所有检测严格按试剂盒和仪器说明书执行。

三、研究方法

抽取受试者静脉血，实验室同时检测其血常规、FPG 和HbA1c。血细胞分类、计数采用鞘流阻抗法、激光散射法、接合荧光染色的流式细胞技术，Hb测定采用比色法，血糖监测采用己糖激酶法，以毛细管电泳法检测系统Sebia Capillary 3 作为参比方法。Hb 电泳采用Sebia Capillary 3 OCTA 血红蛋白电泳仪，Hb 测序采用Applied Biosystems 3730XL 测序仪。HbA1c 正常值范围为4.0%～6.0%。

四、统计学处理

采用SPSS22.0 统计软件对两种仪器HbA1c 检测结果进行分析处理，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结果

一、Hb 变异体分离率及类型

5 068 份血液样本中，共检出Hb 变异体20 份，占总数的0.39%，变异体包括10 份HbG-Taipei，3份HbG-Honolulu，2 份HbE，2 份 HbQ-Thailand，1 份HbG-Coushatta，1 份HbUbe-2 和1 份HbNew York。

二、Hb 变异体样本HbA1c 检测差异性

将20 例HbA1c 异常者编号1～20，表1显示，以Sebia Capillary 3（毛细管电泳法）作为参比仪器，TOSOH HLC-723G8 （离子交换高效液相色谱法）和Sebia Capillary 3 TERA（毛细管电泳法）检测，结果除HbNew York 外，其他均表现为负偏倚。10 份HbG-Taipei 变异体样本中，离子交换高效液相色谱法检测HbA1c 偏倚率均>20%，且该方法将5 份HbA1c 异常样本误判为正常（编号分别为3、4、9、15和17）。离子交换高效液相色谱法与毛细管电泳法的HbA1c 检测结果分别为（4.66±0.86）%和（6.19±0.88）%，差异有统计学意义（t=-9.37，P<0.001）。

表1 Hb 变异体样本来源患者空腹血糖及其HbA1c 检测结果（n=20）

三、基因测序结果

经基因测序结果显示，20 份变异体样本均与Hb 电泳分析型别结果一致，测序突变位点及其突变氨基酸详见表2。

表2 Hb 变异体基因突变信息（n=20）

四、Hb 变异体电泳图

图1为α 链Hb 变异体电泳图，包含HbGHonolulu、HbUbe-2 和HbQ-Thailand 等类型，图2为β 链Hb 变异体电泳图，包含HbG-Taipei、HbG-Coushatta、HbE 和HbNew York 等类型。

图1 杭州地区α 链Hb 变异体电泳图

图2 杭州地区β 链Hb 变异体电泳图

讨论

了解Hb 变异体的携带情况，并采用精准的方法进行不同变异体的检测，有助于地中海贫血的早发现和早治疗。2001年全国大规模分子流行病学调查研究发现Hb 变异体基因携带率为0.33%，其中长江以南地区为0.367%[2]，高于全国水平，因此对杭州地区Hb 变异体的流行情况进行检测，对疾病防控有着重要意义。

一、杭州地区Hb 变异体流行以HbG-Taipei 类型为主

本研究发现杭州地区变异体携带率为0.4%，略高于长江以南地区报道[2]。全球已经发现的Hb 变异体有1 000 余种，其中最常见的为HbS、HbC、HbE及HbD[7]。本研究对杭州地区发现的20 份变异体血样本进行测序发现，主要的Hb 变异体为HbGTaipei，占总变异体的50%。HbG-Taipei（β22 谷氨酸→甘氨酸）是Blackwell 等[8]于1969年在我国台湾地区汉族人中首次发现的，之后在我国多个省份的汉族及少数民族中均有发现。目前认为HbGTaipei 为中国特有的一种Hb 变异体[9]。HbG-Taipei和Hb A 具有相同的氧亲和力，变异后只引起分子表面电荷的变化，而不会影响Hb 结构的稳定性或引起高级构象的改变，患者临床症状往往不明显。文中的10 例HbG-Taipei 携带者，均未表现出血液系统相关疾病。目前HbG-Taipei 虽在国内外华人中多有报道[10-11]，但如此高比例HbG-Taipei 的出现，值得本地区深入探究其流行和播散趋势。

二、HbG-Taipei 变异体对HbA1c 检测有一定影响

近期研究发现HbS、HbC、HbE 和HbG 等变异体对HbA1c 会产生一定干扰，离子交换高效液相色谱法受干扰最为明显[12]。分析其原因，主要是离子交换高效液相色谱法虽对HbA1c 具有很强的分辨能力，但其未能将Hb 变异体和HbA0、HbA1c 完全分离，造成HbA1c 检测结果受干扰。随着糖尿病发病率的逐年升高以及Hb 变异体分布区域的逐渐扩大，常见Hb 变异体对HbA1c 影响的结果解读变得越来越重要。HbG-Taipei 变异体对HbAlc 检测系统的影响，国内外少有报道，2012年曾有1 例HbGTaipei 携带者FPG 为9.6 mmol/L,离子交换高效液相色谱法检测HbA1c 结果正常的报道[13]。本研究发现的10 份HbG-Taipei 变异体样本中，离子交换高效液相色谱法检测HbA1c 偏倚率均>20%，且该方法将5 例HbA1c 异常者误判为正常。离子交换高效液相色谱法HbA1c 检测系统目前临床实验室中应用广泛[12]，因此今后使用过程中应随时关注Hb 变异体的影响。

毛细管电泳法检测HbA1c 技术2012年首次推出[14]，其能准确将正常和异常Hb 区分开来，从阴极到阳极依次为HbA2、HbE、HbS、HbD、HbF、HbA0、其他HbA、HbG、HbA1c 和HbH 等，因此能反映异常Hb 携带者的真实HbA1c 水平，目前国内关于该新技术的临床应用较少[15]。本研究发现该方法不仅能准确检测HbA1c 水平，还能对变异体进行Hb 电泳分析。

综上所述，HbG-Taipei 为杭州地区最为流行的Hb 变异体。相比离子交换高效液相色谱法，毛细管电泳法检测系统在HbG-Taipei 变异体样本HbA1c检测中更能准确反映受试者真实血糖水平。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明吴宣岚：数据分析、设计实验和文章撰写；饶舜：数据收集、统计分析；吴胜军：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导和经费支持