多发性硬化患者抗EB病毒抗体阳性检出率的Meta分析

张敏杰，高玉芳，赵莹，王文娟

多发性硬化(MS)是CNS的炎性自身免疫性疾病，累及髓鞘和轴突发生进行性损伤从而导致神经退行性变[1-2]。MS具有特异性的临床症状，包括复视、虚弱、音调失调、感觉丧失或错乱、肠和膀胱功能异常等。多项针对成人和儿童MS患者的研究[3-5]表明，EB病毒(EBV)感染会增高患MS的风险。儿童感染EBV通常表现为无症状感染，40%的成年人感染EBV后表现为急性传染性单核细胞增多症(IM)，伴有发烧、咽喉痛、疲劳，体格检查可发现咽炎和淋巴结炎[6]。这种与年龄差异有关的疾病其病理机制尚不清楚。Handel等[7]的一项Meta分析结果表明，具有IM病史的患者发生MS的合并相对风险为2.17，IM病史是发生MS的一项危险因素，使MS危险显著增加。Goldacre等[8]通过基于病例-对照研究和队列研究分析探讨了患IM后发生MS的风险。该研究指出，在诊断为IM之后10年或更长时间发生MS风险增加，且持续时间超过30年。Ascherio等[9]对可导致MS的环境风险因素进行分析发现，EBV阴性个体患MS风险比EBV阳性个体低15倍。该研究明确指出任何年龄段的EBV感染都是MS的主要危险因素。在美国国防军的一项大规模前瞻性调查[10]发现，EBV阴性个体出现原发性EBV感染与MS发生直接相关，证实EBV是MS的主要危险因素。上述这些大型的流行病学调查结果及相关研究均显示EBV感染在MS的发病过程中起到重要作用。基于此，本研究检索国内外对MS患者及对照者血清中EBV抗体进行检测的病例-对照研究，对其之间的相关性进行Meta分析，为MS早期诊断以及临床免疫干预提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 文献检索 计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI)、万方科技期刊全文数据库、PubMed、EMbase、和维普中文科技期刊全文数据库(VIP)中对MS患者血清中抗EBV抗体进行检测的病例-对照研究，检索时限从建库到2021年12月。中文检索主题词为“多发性硬化症”或“MS”、“EB病毒”或“疱疹病毒4”，英文检索词包括“multiple sclerosis”或“MS”、“Epstein-Barr Virus”或“Herpesvirus 4”。为补充获取更多文献，以手工检索方式对纳入研究的参考文献检索筛查。

1.2 文献纳入与排除标准 文献纳入标准：(1)研究中纳入病例为MS患者，且为病例-对照研究。(2)检测项目为血清中抗EBV抗体(IgM/IgG/IgA)，并明确抗原类型如EBV衣壳抗原(EBV-VCA)、早期抗原(EBEA)或核心抗原(EBNA)。检测抗-EBNA抗体对应抗原类型包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3，均可纳入研究。(3)检测方法有明确的定性判断的标准。(4)能够从原文中提取完整数据或根据检测结果能计算出所需数据。(5)所有纳入病例均符合相应疾病的诊断标准。排除标准：(1)临床症状分析、综述、病例报道、无全文的会议内容的摘要。(2)未指明所测抗体对应EBV抗原类型。(3)纳入研究对象为疑似MS患者或者MS前期患者。(4)非人类研究、未对所有研究对象血清进行检测。(5)研究对象为特殊人群(如孕妇)或者合并其他恶性疾病(如白血病、肿瘤)、免疫缺陷、免疫功能低下或者正在接受免疫抑制治疗者。(6)病例组或者对照组任意一组研究对象少于30例的小样本研究。(7)同一作者对同一人群进行的重复研究或重复发表的研究。

1.3 数据提取 数据提取由两名研究者独立完成。收集的数据包括第一作者和出版年份、病例组和对照组总数、性别比例、对照组患者类型、抗EBV抗体分类、检测方法、质量评分结果。

1.4 评估研究质量 根据本研究的需要以及纳入文献均为血清学研究的特点，为了使质量评价能够客观反映血清学研究的水平，全面评价研究间的差别，对纽卡斯尔-渥太华量表(NOS)中“暴露评估标准”进行修改，其余两个方面“人群的选择”以及“组间可比性”评价条目未改变，修改后的NOS量表满分是10分。

1.5 异质性评估 采用异质性指标(I2)评估纳入研究之间的异质性。I2≤50%(P>0.05)表示无统计学异质性，采用固定效应模型合并效应量;I2>50%(P<0.05)则表示存在统计学异质性，采用随机效应模型合并效应量。异质性较大时采用亚组分析寻找异质性来源。

1.6 统计学方法 采用Rev Man 5.3和Stata 12软件进行Meta分析并生成森林图。计数资料以OR为效应量指标，各指标均以95%CI表示。采用Egger检验评估纳入研究是否存在发表偏倚，P>0.05表明不存在发表偏倚。通过逐一剔除纳入研究重新进行数据合并来分析纳入不同抗原抗体检测研究之间的敏感性，以判断Meta分析结果的稳定性和可靠性。

2 结 果

2.1 检索结果 2名研究者按照事先制定的检索策略进行文献检索，初检检索词获得文献共1 521篇，结合纳入标准和排除标准详细阅读摘要进行筛选获得文献351篇，详细阅读全文并进行数据提取最终纳入文献35篇[3，11-44]，34篇英文文献，1篇中文文献。MS组样本量中值为114(30～585)，对照组样本量中值123(30～1 001)。共计MS患者4 602例，对照者6 119例。纳入研究的基本信息见表1。

表1 纳入文献基本情况文献作者年份病例组总数男/女对照组类型(例)男/女抗EBV抗体检测方法质量评分Maple等[11]20207821/57健康人(124)48/76VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)ELISA7Deeba等[12]201913351/82健康人(101)40/61VCA(IgG)、EBNA-1(IgG) 、EBEA-D(IgG)ELISA8Gieβ等[13]201710032/68健康人(60)33/27VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)化学发光7Karampoor等[14]201660不详健康人(50)16/34VCA(IgA/IgM)、EBNA-1(IgG)化学发光5Mouhieddine等[15]2015249101/148健康人(230)84/146VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)化学发光6Abdelrahman等[16]20147527/48N-MS(75)不详VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)ELISA4Ramroodi等[17]20137822/56健康人(123)34/89VCA(IgG/IgM)EIA5Pandit等[18]201314058/82健康人(140)58/82VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA8Sundqvist等[19]2012585不详不详(664)不详EBNA-1(IgG)ELISA4Hon等[20]2012310/31健康人(30)0/30VCA(IgG/IgM)ELISA6Waubant等[3]201118965/124OND(38)健康人(28)22/44VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)ELISA7Villegas等[21]20117614/62小手术者(75)26/49EBNA-1(IgG)ELISA5Lucas等[22]2011206不详不详(217)不详VCA(IgG)、EBNA(IgG)、EBEA(IgG)ELISA2Sellner等[23]20105517/38OIND(7)NIND(29)健康人(20)26/30EBNA-1(IgG)ELISA6Nociti等[24]201026776/191CIDP(50)ALS(88)26/2446/42VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)CLIA5Lindsey等[25]20108029/51不详(80)29/51VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)ELISA6Jaquiéry等[26]201040不详OINDNIND(83)不详VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA3Jafari等[27]2010114不详NIND(62)不详EBNA-1(IgG)ELISA3Riverol等[28]200717266/106健康人(85)不详EBNA(IgG)ELISA4Banwell 等[29]200713754/83ONDND (49)健康人(47)不详VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)ELISA4毛悦时等[30]20066523/42OND(71)NND(42)30/4118/24VCA(IgG)、EBNA(IgG)、EBEA(IgG)ELISA6Zivadinov等[31]200614050/90健康人(131)47/84VCA(IgG)ELISA5Pohl等[32]200614749/98ALD或NB(47)健康人(100)不详VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)IF和ELISA3Ponsonby等[33]200513442/92健康人(272)88/184VCA(IgG)ELISA6Buljevac等[34]200554不详健康人(52)不详EBEA(IgG)ELISA4

续表文献作者年份病例组总数男/女对照组类型(例)男/女抗EBV抗体检测方法质量评分Sundström等[35]200423442/192健康人(702)不详VCA(IgG)、EBNA-1(IgG)IF和ELISA4Haahr等[36]200415331/122健康人(1001)不详EBNA-1(IgG)ELISA3Alotaibi等[37]20043013/17健康人(90)捐骨髓者(53)35/5532/21VCA(IgG)、EBNA(IgG)、EBEA(IgG)ELISA4Villoslada等[38]20039833/65健康人(50)16/34EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA4Gutiérrez等[39]20024118/23OND(31)13/18VCA(IgG)ELISA2Ascherio等[40]20011440/144健康人(288)0/288VCA(IgG)、EBNA(IgG)IF3Wandinger等[41]200010841/67非神经系统疾病(163)74/89EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA5Wagner等[42]200010740/67健康人(163)不详EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA8Myhr等[43]199814461/83妇科疾病、整形外科疾病或外伤性骨折的患者(170)77/93VCA(IgG/IgM)、EBNA(IgG) 、EBEA(IgG)IF和ELISA3Munch等[44]199813857/81健康人(138)不详EBNA-1(IgG)、EBEA(IgG)ELISA3 注:N-MS:非多发性硬化症; EIA:酶免疫分析法; OND:其他神经系统疾病; OIND: 其他炎症性神经系统疾病; NIND:非炎症性神经系统疾病; ONDND:其他非脱髓鞘性神经系统疾病; CIDP:慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病; ALS:肌萎缩侧索硬化症; CLIA:间接化学发光免疫法; NND:非神经科疾病; ALD:肾上腺脑白质营养不良; NB:神经母细胞瘤; IF:免疫荧光法

2.2 质量评价 根据修改后NOS量表，3项研究[12,18,43]获得最高分8分，35项研究总体得分中值5分(2～8)。各研究总体得分见表1。

2.3 Meta分析结果

2.3.1 EBV-VCA IgM 有4项研究对EBV-VCA IgM进行检测，共计MS患者313例，对照者373例。MS患者EBV-VCA IgM血清阳性率中值28.02%(1.39%～86.67%)，对照者13.70%(0.59%～60.00%)，MS患者血清EBV-VCA IgM阳性总百分率24.92%(78/313)高于对照者11.53%(43/373)。纳入分析各研究之间无异质性，采用固定效应模型合并结果，总体OR值为3.44(95%CI：1.93～6.13)，合并效应量检验结果(Z=4.18，P<0.01)，MS患者血清EBV-VCA IgM阳性率明显高于对照者，差异有统计学意义(图1)。

2.3.2 EBV-VCA IgG 本Meta分析共有21项研究对EBV-VCA IgG进行检测，共计MS患者2 761例，对照者3 437例。MS患者EBV-VCA IgG血清阳性率中值为98.06%(85.71%～100%)，对照者93.48%(43.17%～100%)，MS患者血清EBV-VCA IgG阳性总百分率97.07%(2 680/2 761)高于对照者89.06%(3 061/3 437)。各研究间异质性较大I2=56%(P=0.001)，随机效应模型合并结果后，总体OR值为4.79(95%CI：2.82～8.15)，合并效应量检验结果(Z=5.78，P<0.01)，MS患者血清EBV-VCA IgG阳性率明显高于对照者，差异有统计学意义(图2)。

图1 MS患者和对照者EBV-VCA IgM阳性率Meta分析森林图

图2 MS患者和对照者EBV-VCA IgG阳性率Meta分析森林图

2.3.3 EBEA IgG 有12项研究对EBEA IgG进行检测，MS患者1 380例，对照者1 537例。MS患者EBEA IgG血清阳性率中值32.78%(5.00%～86.41%)，对照者21.09%(4.76%～82.49%)，MS患者血清EBEA IgG阳性总百分率38.33%(529/1 380)高于对照者33.77%(519/1 537)。各研究间异质性较大I2=69%(P=0.0002)，随机效应模型合并后，总体OR值为1.33(95%CI：0.94～1.88)，合并效应量检验结果(Z=1.6，P=0.11)，MS患者与对照者EBEA IgG血清阳性率差异无统计学意义(图3)。

图3 MS患者和对照EBEA IgG阳性率Meta分析森林图

2.3.4 EBNA IgG 有27项研究对EBNA IgG进行检测，MS患者3 990例，对照者5 245例。MS患者EBNA IgG阳性率中值97.92%(44.90%～100%)，对照者89.86%(48.00%～98.39%)，MS患者血清EBNA IgG阳性总百分率94.79%(3 782/3 990)高于对照者84.25%(4 419/5 245)。研究间异质性较大I2=70%(P<0.01)，随机效应模型合并后，总体OR值4.45(95%CI：2.87～6.89)，合并效应量检验结果(Z=6.67，P<0.01)，MS患者血清EBNA IgG阳性率高于对照者，差异有统计学意义(图4)。

2.4 亚组分析 为寻找对EBV-VCA IgG、EBNA IgG进行检测的各个文献之间异质性的来源，分别按对照类型(分为健康对照、疾病对照)、抗EBV抗体检测方法(分为ELISA法和非ELISA法)进行亚组分析。将对EBV-VCA IgG进行检测的文献分为“健康对照”组与“疾病对照”组。有1项研究[23]对照人群类型不详，2项研究[21,30]对照类型包含了健康人和疾病患者，亚组分析未将这3项研究纳入分析。“健康对照”组(共计11项研究)合并总体OR值为2.86(95%CI：1.20～6.83)，检验结果Z=2.37(P=0.02)。“疾病对照”组(共计7项研究)合并总体OR值为10.98(95%CI：4.36～27.70)，检验结果Z=5.08(P<0.01)。两亚组总体OR结果与未分组结果一致，但“健康对照”组结果的可信区间更窄，两组间的异质性均消除，组间异质性检验结果χ2=4.31(P<0.05)，差异有统计学意义。对EBNA IgG进行检测的文献，有6项研究对照人群类型不详或包含了健康人和疾病患者，亚组分析未将这些文献纳入。“健康对照”组(共计13项研究)合并总体OR值为5.95(95%CI：2.63～13.48)，检验结果Z=4.28(P<0.01)。“疾病对照”组(共计8项研究)合并总体OR值为2.80(95%CI：1.64～4.76)，检验结果Z=3.78(P=0.0002)。“健康对照”组与“疾病对照”组两亚组合并总体OR结果与未分组结果一致，“疾病对照”组异质性消除，组间异质性检验χ2=2.61(P=0.27)，差异无统计学意义。

按抗EBV抗体检测方法不同进行分组，分为“ELISA”组和“非ELISA”组。EBV-VCA IgG亚组分析结果，“ELISA”组(共计15项研究)合并总体OR值为4.72(95%CI：2.33～9.56)，检验结果Z=4.31(P<0.01)。“非ELISA”组(共计6项研究)合并总体OR值为3.83(95%CI：2.04～7.17)，检验结果Z=4.19(P<0.01)。组间异质性检验结果χ2=0.19(P=0.66)，差异无统计学意义。EBNA IgG亚组分析结果，“ELISA”组(共计21项研究)合并总体OR值为4.34(95%CI：2.52～7.49)，检验结果Z=5.28(P<0.01)。“非ELISA”组(共计6项研究)合并总体OR值为4.42(95%CI：2.73～7.15)，检验结果Z=6.06(P<0.01)。组间异质性检验结果χ2=0.00(P=0.96)，差异无统计学意义。各亚组合并总体OR结果与未分组结果一致，“非ELISA组”异质性均消除。

图4 MS患者和对照者EBNA IgG阳性率Meta分析森林图

2.5 发表偏倚评估 采用Egger检验分析评估EBV-VCA IgG、EBEA IgG研究的发表偏倚，检验结果分别为t=-0.02(P=0.983)、t=-0.43(P=0.676)，说明纳入的研究不存在发表偏倚。对EBNA IgG进行检测的纳入研究发表偏倚检验结果为t=2.73(P=0.011)，可能存在发表偏倚。

3 讨 论

MS是一种临床表现复杂多样的特发性炎症性脱髓鞘疾病，由于缺乏特异性辅助检查指标使得MS的诊断困难重重，且其高致残率又使得临床治疗面临巨大挑战。影像学检查只能在疾病累及大脑和脊髓发生损伤的情况下进行辅助诊断，同时根据我国人群特点还应与视神经脊髓炎谱系疾病进行鉴别诊断。现代观点普遍认为MS是由发生在CNS的适应性免疫反应损伤造成的，这与血-脑屏障功能障碍，少突胶质细胞凋亡以及白质和灰质内脱髓鞘的发生有关。EBV在MS的发病中具有重要意义，但其具体致病机制错综复杂，目前尚未完全阐明。有研究[45]对人类白细胞抗原(HLA-DRB1*1501)单倍型及EBNA-1抗体在MS发病中的作用进行研究。这项针对148例女性病例的病例-对照研究对EBNA-1抗体之于MS的作用与遗传易感性这两种不同危险因素之间的关系进行分析后发现，这两个因素均可独立导致MS风险增加，并且这两个因素均为阳性的女性比这两个因素均为阴性的女性导致MS的风险高出9倍。HLA-DRB1*1501基因阳性及高水平的EBNA-1抗体都可以导致患MS的风险明显增高。无论成人还是儿童MS患者，高水平的EBNA-1抗体与风险基因HLA-DRB1*1501是MS致病的两个独立的危险因素。本Meta分析结果也显示，MS患者EBNA IgG血清阳性总百分率为94.79%高于对照的84.25%;EBV-VCA IgG血清阳性总百分率为97.07%高于对照的89.06%，印证了EBNA抗体是MS致病的独立风险因素。EBNA-1是EBV潜伏感染状态下表达产物，血清中EBNA-1 IgG出现迟缓，该抗体的存在排除了急性感染，而本研究发现MS患者除EBNA IgG外，EBV-VCA IgG阳性总百分率也增高，提示EBV原发感染后能够在宿主细胞中继续潜伏感染，通过潜伏期基因表达产物及相关蛋白参与MS致病。国外Jog等[46]的研究发现，与健康对照者相比，MS患者可识别EBNA-1独特表位，与MBP发生交叉反应，并通过动物实验发现使用EBNA-1独特表位序列免疫小鼠可诱发实验性自身免疫性脑炎(EAE)。其他对MS患者和啮齿类动物实验获得性EAE的研究也发现多种CNS蛋白，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和蛋白脂蛋白(PLP)为MS自身免疫反应的靶点[1-2]。以上研究深入分析了EBV如何在宿主体内实现潜伏感染，以及如何通过表观遗传控制实现表达与MS致病相关的潜伏期基因产物及相关蛋白，并通过动物实验证实了EBV基因产物与MS靶抗原之间的相关性。本Meta分析结果进一步为EBV感染导致MS发病的“分子模拟理论”提供了有力的证据支持。

本研究中MS患者EBV-VCA IgM血清阳性总百分率为24.92%明显高于对照的11.53%，差异有统计学意义。EBV-VCA IgM是EBV原发感染的标志物，先前本小组的研究[47]显示，IM患者血清EBV-VCA IgM总阳性率为82.30%高于对照者的5.96%。结合近年的研究发现IM病史是发生MS的一项风险因素，使得患MS风险显著增加，解释了部分MS患者血清EBV-VCA IgM增高的潜在原因。此外，本研究发现MS患者血清EBEA IgG阳性总百分率(38.33%)与对照组(33.77%)之间的差别无统计学意义。但纳入的各个研究之间异质性较大(I2=69%，P=0.0002)，通过敏感性分析剔除两项研究后，异质性明显降低(I2=17%，P=0.29)，合并效应量检验结果(Z=0.58，P=0.56)与剔除前相同。分析这两项研究造成异质性原因，发现其中一项为国内研究[30]，可能与研究人群种族差异有关。另外一项研究[43]采用IF检测EBEA IgG，检测方法的差异也可能是产生异质性的原因。对EBV-VCA IgG进行检测的各个研究之间异质性较大，对其进行了亚组分析。亚组分析结果表明，对照人群的选择是导致异质性产生的原因。但对检测EBNA IgG抗体的各个研究之间的异质性进行亚组分析结果显示，各亚组之间差异无统计学意义，且存在发表偏倚。本研究通过Meta分析探索抗EBV抗体与MS之间的相关性，基于MS发病过程与EBV感染密不可分的相关性研究，深入探讨了EBV感染的免疫应答及“分子模拟理论”在介导MS发病中的潜在机制, 期待研究结果能为MS早期诊断以及临床免疫干预治疗提供依据。