两种检测饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E测定方法的比较分析

司慧民，元雪浈，全晓萍，陈 蔷，韩 立

（河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008）

维生素是维持生命活动所必需的一类物质。随着营养生理学研究的深入，人们对维生素在动物营养中的作用有了新的认识，开始注意到维生素的重要作用[1-2]。维生素在生物体内的含量很少，但不可或缺。当动物机体缺乏维生素时，动物的生长发育以及繁殖机能就会受到影响，缺乏严重时甚至会引起特殊疾病。虽然目前畜禽病临床中典型的维生素缺乏症并不多见[3-4]，但在生产实践中添加维生素制剂可以提高动物的饲料转化效率，促进发病畜禽康复。

维生素分为水溶性和脂溶性两大类[5]。水溶性维生素因其在动物体内不能蓄积，所以短期超量危害甚微。但是脂溶性维生素能够在动物体内蓄积，长期超量就会产生有害影响。维生素化学性质极其不稳定，容易受到金属离子的影响从而发生氧化，在酸、碱和光照的环境中也易分解[6]，因此快速准确地测定饲料中维生素的含量对防止维生素缺乏症、维生素中毒、维生素的稳定性以及制定合理的维生素加工工艺和储存条件等具有重要意义。

维生素 A 乙酸酯（VA）、维生素 D3（VD3）和维生素E（VE）在饲料中被广泛使用，其在饲料中的含量直接影响饲料的品质。现行的国家标准[7]是3种维生素检测的单独标准。采用传统处理方法，包括皂化破壁、有机溶剂萃取、浓缩、色谱净化、正相分离及质谱检测等步骤[8-12]，涉及多次蒸发溶解，操作步骤复杂，费时费力，容易造成待测组分损失，导致测定结果偏低且重现性不好。本试验旨在选择可同时检测出饲料中VA、VD3和VE的含量，并且具有灵敏度和准确度高、检测速度快等特点的定量检测方法，从而为饲料中VA、VD3和VE含量的测定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 饲料样品。猪浓缩饲料1、2、3和猪预混合饲料1、2、3均系市场自购,样品用钢磨粉碎并过40目筛，置于塑料自封袋中，阴凉干燥保存备用。

1.1.2 主要仪器。Waters UPLC超高效液相色谱仪（二极管矩阵检测器）（美国Waters公司）；超声波清洗器（可调温度20～80℃）（昆山市超声仪器有限公司）；PL403IC型电子分析天平 （梅特勒上海有限公司）；超纯水仪（美国 Millipore公司）；0.22μm有机系滤膜（天津津滕公司）。

1.1.3 主要试剂。甲醇（色谱纯，上海安谱）；氨水（分析纯，天津科密欧）；乙醚（优级纯，天津科密欧）；L-抗坏血酸（优级纯，阿拉丁）；碱性蛋白酶（酶活力每克大于4000单位）；维生素A乙酸酯(纯度≥99.0%，中国食品药品检定研究院)；胆钙化醇（纯度≥99.0%，First Standard）；dl-α-生育酚乙酸酯（纯度≥99.0%，中国食品药品检定研究院）。

1.2 试验设计

将处理好的猪浓缩饲料1、2、3和猪预混合饲料1、2、3分别按照快速测定法和国标方法进行样品处理，并分别测定其中VA、VD3和VE的含量，每种饲料样品在使用2种测定方法测定时分别设置3个平行。

1.3 试验方法

1.3.1 快速测定法。溶液的配制。氨水溶液：取水适量，用氨水调节pH值为8～10；标准储备溶液：分别准确称取VA（维生素A乙酸酯，纯度≥99.0%）标准品34.4mg（精确至 0.00001g）、VD3（胆钙化醇，纯度≥99.0%）标准品 10.0mg（精确至 0.00001g）、VE（dlα-生育酚乙酸酯，纯度≥99.0%）标准品50.0mg（精确至0.00001g）于100mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，-18℃避光保存，有效期为6个月；混合标准储备溶液：分别吸取VA、VD3和VE标准储备溶液0.2、0.1、1.0mL于10mL棕色容量瓶，用甲醇稀释并定容，冷冻避光保存，有效期为2周。

样品前处理。称取适量试样（复合预混合饲料3g，维生素预混合饲料0.3g，浓缩饲料5～10g）精确至0.0001g，置于150mL的棕色锥形瓶中，加入15mL氨水溶液（pH值为8～10）（必要时加入吡咯啶二硫代甲基羧酸铵0.5g）振摇2min，再加入0.2g碱性蛋白酶于55～65℃水浴中超声溶解20min（其间摇动3～5次），取出放入冷水浴中降温，待降至室温后加入25mL甲醇（分析纯），常温超声提取15min（其间摇动2～3次），取出，转移至50mL离心管中，10000r/min离心5min，将上清液转移至100mL棕色容量瓶中，残渣用30mL甲醇（分析纯）重复提取1次，合并2次上清液，用甲醇定容至刻度。过0.22μm滤膜，上机测试。

色谱测定。色谱条件：色谱柱：C18柱（柱长100mm；内径 1.7mm；粒度 1.7 μm）；流动相：甲醇+水=95+5；流速：0.3mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测波长：325nm（0～4.0min）；265nm（4.1～7.0min）；280nm（7.1～12min）。

定量测定。在仪器正常工作条件下，取试样溶液和相应的标准工作溶液上机进样，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量。标准工作溶液和试样溶液中VA、VD3和VE的峰面积均应在仪器检测的线性范围内。在试样液进样过程中应参考标准工作液，以便定性定量准确。

1.3.2 国标方法。VA、VD3和VE的国标方法测定、试剂配制和样品处理及色谱条件详见对应国家标准[13-15]。

1.4 数据分析

对测定结果使用SPSS22.0统计学软件进行统计分析，每种样品2种测定方法间的比较采用数据样本t检验法，6种样品整体间的比较采用配对数据的t检验法，数据以"平均数±标准差"表示。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

图1为快速测定法测定饲料中VA、VD3及VE定量测定过程中混合标准溶液的色谱图；图2、图3和图4为国标方法测定饲料中VA、VD3、VE的图谱。由上图可以看出，快速测定法可以实现液相色谱上机1次测定出饲料中VA、VD3、VE的含量，国标方法液相色谱上机3次才能测定出饲料中VA、VD3、VE的含量。

图1 VA、VD3、VE混合标准溶液色谱图

图2 VA标准溶液色谱图

图3 VD3标准溶液色谱图

图4 VE标准溶液色谱图

2.2 VA、VD3及VE的含量测定

使用2种方法对6种预混合饲料和浓缩饲料进行检测，所得VA、VD3和VE含量结果见表1～表4。由表可知，6种饲料中VA、VD3及VE的含量使用快速测定法所得结果均高于国标方法；利用快速提取法测得3号猪浓缩饲料中VA和VE含量以及3号猪预混合饲料中VD3和VE含量均显著高于国标方法（P<0.05）；整体比较分析结果显示，利用快速测定法测定猪浓缩饲料中VA的含量显著高于国标方法（P<0.05），猪预混料使用2种测定方法所得3种维生素含量差异均不显著（P>0.05）。

表1 猪浓缩饲料中VA、VD3及VE含量的测定

表2 猪预混合饲料中VA、VD3及VE含量的测定

表3 猪浓缩饲料VA、VD3及VE含量测定结果的整体比较

表4 猪预混合饲料VA、VD3及VE含量测定结果的整体比较

3 讨论

采用传统国标方法测定饲料中VA、VD3和VE时，需按照3种维生素对应的国标方法[13-15]分别提取3次，再使用高效液相色谱仪在不同的色谱条件下进行3次上机测定，该方法耗时长，步骤复杂，容易造成被测组分的损失，影响准确度。快速测定法可在15min内完成3种维生素的提取，并且VA、VD3和VE的含量在高效液相色谱仪上上机1次即可测得。快速测定法优化了提取步骤，使得饲料中VA、VD3和VE在提取的过程中损失减少。因此，快速测定法更加高效便捷。

从快速测定法和国标方法提取饲料中VA、VD3和VE的结果来看，快速测定法比国标方法测得结果的平均值大，可能是因为快速测定法提取步骤的优化减少了提取过程中被测组分的损失，从而获得比国标方法更准确、更可信的数据，故快速测定法较国标方法具有更高的灵敏度和准确度。

4 结论

快速测定法具有快速、准确和灵敏的特点，适合对饲料中VA、VD3和VE多组分一次性定量检测。