微波辅助提取紫花苜蓿总黄酮工艺的优化

张佳睿，张丹丹，李佳乐，李晨阳，杨镇才，李珊珊，刘丽杰，李波

（齐齐哈尔大学 1.生命科学与农林学院，2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是豆科重要的牧草，其具有极强的适应能力及生态功能，对我国生态环境的建设及改善具有积极作用[1].我国对苜蓿的应用主要集中在上游产业，对其次生代谢产物的生物学功能活性研究相对较少.随着研究人员对紫花苜蓿的深入研究，人们对其营养价值有了一定的了解，以苜蓿为原料的食品和保健品逐渐被人们所接受.作为畜牧业及养殖业的优质饲草，紫花苜蓿在生长过程中会积累皂苷、黄酮类、香豆素等多种次生代谢产物[2]，主要储藏在苜蓿的茎、叶、根等部位.在对紫花苜蓿的开发利用中，目前从中提取出的黄酮类化合物已高达50 余种，所表现出来的生理、药理活性也与其含有较多的黄酮类化合物密切相关[3].

黄酮类化合物结构复杂，种类较多，各种植物中的黄酮类物质具有较大差异[4-5].依据黄酮类化合物的特点可选择相应的提取方法，常用的提取方法有浸提法、回流提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等[6-8].其中，微波辅助提取法是微波与有机溶剂萃取相结合的产物，利用电磁加热原理，使微波穿透有机溶剂，直接作用于萃取材料，提高植物活性物质的萃取效率.微波辅助提取法提取效率高、速度快、对植物活性物质的产物得率较高[9]，可有效保存食品、药品及其它物料中的有效成分.微波提取过程受物料比、乙醇体积分数、微波功率、微波提取时间等不同因素的影响.本文以龙牧801 紫花苜蓿干粉为材料，设计单因素和正交实验，优化微波辅助提取苜蓿总黄酮工艺，为开发利用苜蓿提供理论依据.

1 实验材料、仪器与试剂

1.1 材料预处理

以龙牧801紫花苜蓿为原材料，于盛花期收割其地上部分，置于避光通风处自然阴干，筛去砂砾、草棒、枯草等杂质，阴干后用高速多功能粉碎机将干草粉碎成草粉，置于密封盒内避光备用.

1.2 仪器与试剂

高速多功能粉碎机（YB-1500A，永康市速锋工贸有限公司）；紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）；微波炉（S7G88C，苏州三星电子有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）；全温振荡摇床（ZD-88，常州金坛中旺仪器制造有限公司）；循环水真空泵（SHZ-DⅢ，巩义市予华仪器有限责任公司）.

芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司）；石油醚（60～90℃，辽宁泉瑞试剂有限公司）；无水乙醇，氢氧化钠，亚硝酸钠，九水硝酸铝（天津市天力化学试剂有限公司）.以上试剂均为分析纯（AR）.

2 实验方法

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标准品，配制不同质量浓度标准液，以NaNO2-Al（NO3）3为显色剂，在λ=510 nm测定吸光度，以芦丁质量浓度为x轴，吸光度为y轴，通过绘制的标准曲线获得回归方程为A=13.893C-0.005 9（R2=0.997 3），总黄酮在质量浓度为0.008～0.048 mg/mL时有良好的线性关系.

2.2 单因素和正交实验设计

2.2.1 基本实验条件 物料比1∶30，乙醇体积分数50%，微波功率800 W，微波提取时间30 s.

2.2.2 每个单因素设计 选取4 个单因素（物料比、乙醇体积分数、微波功率、微波提取时间），每个单因素设置5 个水平，其中物料比（g∶mL）为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50；乙醇体积分数为40%，50%，60%，70%，80%；微波功率为180，300，450，600，800 W；微波提取时间为10，20，30，40，50 s.每组单因素实验独立重复3 次.

2.2.3 正交实验设计 依据单因素实验结果，每个因素选择3 个水平，按L9（34）正交实验表进行设计（见表1），得出优选因素组合，确定微波辅助法提取紫花苜蓿总黄酮最优工艺.

表1 正交实验因素和水平

2.3 总黄酮的提取和含量测定

按照设定的物料比加入一定体积分数的乙醇，在室温、120 r/min条件下震荡浸泡1 h，使苜蓿中总黄酮类物质充分溶出，浸泡完毕后进行微波处理.在微波炉转盘中央放置一个装有适量自来水的大烧杯用于吸热，将装有待提取样本的三角瓶围绕大烧杯周围依次摆放，按照设定好的参数进行微波处理，每次微波处理10 s后将三角瓶取出，降至室温后再进行下一次微波处理，直至达到规定时间，每组处理3次重复.过滤得浸提液，将浸提液加入等体积的石油醚萃取，再用旋转蒸发仪进行减压蒸发至膏状物，用体积分数60%的乙醇重新定容至50 mL，取5mL置容量瓶中，再按照标准曲线的绘制方法进行显色和OD值测定.

依据回归方程计算样品中总黄酮提取量，Y=cVn m，其中：c为总黄酮的质量浓度（mg·mL-1）；V为总黄酮提取液的体积（mL）；n为提取液稀释的倍数；m为苜蓿草粉的质量（g）.

2.4 验证性实验

准确称取1.00 g 备用苜蓿干粉4份，以最佳工艺进行验证实验，测其吸光度，并计算总黄酮提取量.

2.5 数据处理与分析

采用Excel2010对数据进行整理，SPSS19.0分析软件对各测定数据进行方差分析（ANOVA）.

3 结果与分析

3.1 微波辅助提取法各单因素对苜蓿总黄酮提取量的影响

微波辅助提取法对苜蓿总黄酮的单因素实验结果见图1.由图1可见，随着物料比、乙醇体积分数、微波功率和微波提取时间的增加，苜蓿总黄酮提取量均呈现先增加后降低的变化趋势.

图1 微波辅助提取的4个因素对苜蓿总黄酮提取量的影响

当物料比从1∶10 增加至1∶20 时，苜蓿总黄酮提取量快速上升，物料比超过1∶20时，总黄酮提取量趋于平缓，当物料比达到1∶30 时，苜蓿总黄酮提取量最高，为2.245 mg·g-1.继续增加物料比时，由于提取溶剂的增加降低了苜蓿总黄酮的提取量，可能是细胞液对微波能量吸收减少，微波作用力变弱[10]，导致细胞破裂不完全，总黄酮提取量下降.物料比1∶10，1∶50 苜蓿总黄酮提取量与物料比1∶20，1∶30，1∶40之间苜蓿总黄酮提取量比较差异显著（P＜0.05）.

在乙醇体积分数在40%～80%范围内，总黄酮提取量呈现先平稳缓慢增长，后剧烈下降的趋势.当乙醇体积分数小于60%时，总黄酮提取量无明显差异，在乙醇体积分数为60%时，苜蓿总黄酮提取量达最大值，为2.050 mg·g-1.继续升高乙醇浓度，苜蓿总黄酮提取量迅速下降，可能是过高的乙醇体积分数影响一些黄酮类成分的溶解性[11].40%，50%，60%与70%，80%苜蓿总黄酮提取量比较差异显著（P＜0.05）.

微波功率在300～450 W 时，苜蓿总黄酮提取量提高尤为明显，总黄酮提取量峰值出现在微波功率450 W条件下，最高提取量为1.789 mg·g-1.当微波功率大于450 W 时，苜蓿总黄酮提取量逐渐下降，微波功率过高，会导致某些黄酮类结构的变性或者降解[12]，使总黄酮提取量降低.除微波功率为450 与600 W，180与800 W，300 与600 W 外，其它各处理间苜蓿总黄酮提取量比较差异显著（P＜0.05）.

当微波提取时间为10～30 s 时，随着微波提取时间的延长，苜蓿总黄酮的提取量迅速提高，在微波提取时间为30 s 时，苜蓿总黄酮提取量最高，为1.916 mg·g-1.但继续延长微波提取时间，苜蓿总黄酮提取量反而下降，可能是随着微波提取时间的延长增加了其它非黄酮类化合物的溶出[13]，影响了总黄酮提取量.除20 与50 s 微波提取时间外，其它各微波提取时间内苜蓿总黄酮提取量比较差异显著（P＜0.05）.

3.2 正交实验优化微波辅助提取条件

根据微波辅助提取法的单因素实验结果进行正交实验，结果见表2.极差（R）值越小该因素对苜蓿总黄酮提取量的影响程度越小，R值越大该因素对苜蓿总黄酮提取量的影响越大，影响苜蓿总黄酮提取量的4 因素R值大小依次为C＞D＞B＞A，即微波功率的影响最大，其次为微波提取时间、乙醇体积分数和物料比.由方差（K）值大小可知，当物料比为1∶30、乙醇体积分数为60%、微波功率为450 W 和微波提取时间40 s 时提取效果最好，从而得出最佳提取工艺为A2B3C2D3.综合分析得出微波辅助法提取苜蓿总黄酮最佳工艺水平组合为物料比1∶30、乙醇体积分数60%、微波功率为450 W、微波提取时间40 s.

表2 微波辅助法正交实验结果分析

采用正交实验分析软件对正交实验结果进行方差分析，结果见表3.由表3 可见，物料比、乙醇体积分数、微波功率和微波提取时间对苜蓿总黄酮提取量的影响均达到显著水平.

表3 苜蓿总黄酮提取量正交实验方差结果分析

3.3 微波辅助提取苜蓿总黄酮的稳定性实验

在正交实验最佳组合提取工艺条件下进行4 次平行稳定性实验.准确称取1 g 苜蓿干粉末，以物料比1∶30，乙醇体积分数60%，微波功率为450 W，微波提取时间40 s 进行微波辅助提取，测定结果见表4.在最佳组合工艺提取条件下，4 次验证实验结果接近，且高于单因素及正交实验中的总黄酮提取量，苜蓿总黄酮的平均提取量为2.179 mg·g-1，说明微波辅助法提取苜蓿中总黄酮的优化工艺稳定可靠.

表4 微波辅助提取法稳定性实验结果

4 讨论

植物生长发育过程产生的次生代谢产物大量存在于根、茎、叶等器官中，这些产物的含量直接影响对其开发和利用.黄酮类物质属于植物次生代谢产物的一种，近年来，关于植物中黄酮类化合物的提取研究得到了长足的发展，多采用微波辅助、超声波辅助和响应面等提取法提高黄酮类化合物的提取效率[14].

前人在利用微波辅助提取黄酮类化合物时，对影响黄酮类化合物提取效率的各单因素进行了不同水平的比较，在此基础上对各因素的互作效率进行正交实验，优化黄酮类化合物的提取工艺.有关苜蓿总黄酮提取的工艺研究中，普遍认为微波辅助提取法提取紫花苜蓿总黄酮的提取效率较高，但不同研究者在物料比、乙醇体积分数、微波功率、微波提取时间等因素对黄酮提取量的影响研究上略有差异.张咏梅[15]等通过单因素实验和正交实验的方法，优化微波辅助提取紫花苜蓿总黄酮的提取工艺，认为影响提取量的主要因素是物料比和乙醇浓度，在最优工艺下（1∶30物料比，40%乙醇体积分数，微波功率500 W，作用时间60 s）的总黄酮提取量为4.88 mg·g-1.与本文在微波辅助提取苜蓿总黄酮的影响因素的结果存在差异，物料比、乙醇体积分数、微波功率、微波提取时间均显著影响苜蓿总黄酮提取量，其中微波功率的影响最大；但在最优提取工艺上物料比和微波功率的筛选上基本一致，乙醇体积分数和微波处理时间上略有差异，导致本研究苜蓿总黄酮量低的原因可能是材料的选择和微波处理功率方面.实验研究可为紫花苜蓿资源利用方面提供有价值的参考依据.

5 结论

在微波辅助提取苜蓿总黄酮时，物料比、乙醇体积分数、微波功率、微波提取时间均对苜蓿总黄酮提取量产生显著影响，微波功率＞微波提取时间＞乙醇体积分数＞物料比.最佳提取工艺为：物料比1∶30、乙醇体积分数60%、微波功率450 W、微波提取时间40 s，此工艺条件下苜蓿总黄酮提取量为2.179 mg·g-1，提取工艺稳定.