克隆单子叶植物启动子及功能验证

卢凌霄，高珊，于洋，王银月，邹春野，于鸿雪，吕小飞

（辽源市农业科学院，吉林 辽源 136200）

1 材料

1.1 植物材料

常规水稻、哥伦比亚生态型（Columbia，Col）拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子均由本实验室保存。

1.2 质粒与菌株

中间载体pUC-19、黄色荧光融合瞬时表达载体pSAT6-EYFP 均由本实验室保存，pEASY-T5 cloning vector 购于北京Transgen 公司，大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞购于北京Transgen 公司。

1.3 试剂盒

PCR 扩增所需引物均在上海生工生物工程公司合成，KOD FX 及rTaq 购买于TOYOBO 生物技术公司，各种DNA 限制性内切酶、T4 连接酶均购买于美国New England Biolabs（北京）公司，DNA Marker 和蛋白Marker 购买于TaKaRa 公司。

质粒提取试剂盒购于GeneStar 公司，DNA 胶回收试剂盒购于Omega 公司。

2 试验方法

2.1 克隆启动子

1）Act2-1启动子克隆。CTAB法提取水稻总DNA，NCBI检索Os Actin2-1 序列（GenBank:EU259512.1 1 008 bp），设计引物，分段PCR 法扩增目标片段P1（880 bp）、P2（120 bp），胶回收片段P1、P2，T4 DNA 连接酶连接两片段得到完整Actin2-1 启动子，克隆载体测序与目标序列比对。启动子序列中存在一个PstI 酶切位点，影响后续载体构建，设计引物突变掉克隆所得片段中的PstI 酶切位点，见表1。

表1 设计引物序列

2）Ubi 启动子改造。玉米Ubiquitin 启动子为实验室保存，序列中有一个EcoR I 酶切位点，影响后续载体构建，需设计引物将酶切位点钝化，改造后的Ubi 启动子需进行功能验证。

2.2 启动子功能验证

2.2.1 黄色荧光瞬时表达载体构建

利用 In-Fusion 方法构建瞬时表达载体pACT-EYFP 和pUBI-EYFP，利用AgeI 和EcoR V 酶切位点以In-Fusion 无缝克隆方法将35S 启动子分别替换为克隆并改造得到的Act2-1 和Ubi 启动子，利用QIAGEN 大提质粒试剂盒提取质粒。

2.2.2 原生质体制备及瞬时转化所需母液

配制200 mL 0.8 mol/L 甘露醇，0.2 mol/L MES，1 mol/L CaCl2，1 mol/L KCl，2 mol/L MgCl2，5 mol/L NaCl，50 mL 10%BSA，灭菌室温保存。

2.2.3 配制工作液

1）酶解液（20 mL）：取0.2 mol/L MES 母液20 mL于70 ℃预热3 min后，加入1.5%Cellulase R10、0.4%Macerozyme R10、0.4 mol/L mannitol、1 mol/L KCl 母液0.4 mL，55 ℃水浴10 min，冷却后加入1 mol/L CaCl2200 μL、10%BSA 200 μL。

2）W5 溶液（100 mL）：取0.2 mol/LMES 1 mL、5 mol/L NaCl 6.16 mL、1 mol/L CaCl212.5 mL、1 mol/L KCl 500μL，加入灭菌的ddH2O 至100 mL。

3）MMG 溶液（100 mL）：取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8mol/L mannitol 50 mL、2 mol/L MgCl21.5 mL，加入灭菌的ddH2O 至100 mL。

4）WI 溶液（100 mL）：取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8 mol/L mannitol 62.5 mL、1 mol/L KCl 2 mL，加入灭菌的ddH2O 至100 mL。

5）PEG 溶液（10 mL）：称取PEG4 g、0.2 mol/Lmannitol 1 mL、1 mol/L CaCl21 mL，加入灭菌的ddH2O 8 mL，55 ℃水浴促进溶解，提前1 h 配制。

2.2.4 制备拟南芥原生质体，并瞬时转化表达载体

1）剪取21 d 左右的未抽薹拟南芥叶片，用刀片将叶片切成细条，浸于5 mL 酶解液中，轻轻摇晃。

2）放入25 ℃培养箱中，用锡箔纸包住避光酶解3 h 后形成绿色酶/原生质体溶液，期间可以汲取少量液体在显微镜下观察原生质体状态。

3）加入W5 溶液5 mL，用75 μm 过滤筛过滤到圆底离心管中。

4）使用水平低速离心机，配平后100 rpm 离心2 min，小心吸出上清液。

5）加入W5 溶液2 mL 重悬，冰上放置30 min，原生质体会沉降至管底。

6）小心吸出清液，加入MMG 溶液2 mL 重悬，按转化的质粒数均匀地分到无菌的离心管中。

7）按每100 μL 原生质体细胞转化1 μg 质粒，将质粒稀释后加到原生质体细胞中，轻轻混匀后，缓慢加入PEG 溶液110 μL（边加边混匀），避光放置10 min。

8）加入W5 溶液400 μL，轻轻混匀后，终止转化反应。

9）以离心力100 g 离心2 min，吸出上清液，加入WI 溶液1 mL 重悬，转移到培养板中。

10）25 ℃避光过夜孵育。

11）取100 μL 溶液于激光共聚焦显微镜下观察启动子启动表达荧光蛋白的情况。

3 结果与分析

3.1 Act2-1 启动子的克隆、改造及测序结果分析

PCR 扩增出的P1、P2 片段进行琼脂糖凝胶电泳，见图1（a），HindⅢ和BamHⅠ双酶切中间载体pUC-19，与酶切处理过的P1、P2 片段连接，获得pUC-Act，菌落PCR 和双酶切验证，见图1（b）和图1（c）。

使用突变PstI 位点引物PCR 扩增，可分别得到830 bp 和210 bp 的两个片段，见图1（d），回收两个片段作为模板扩增得到突变了酶切位点的完整Act2-1启动子片段，回收片段连接到克隆载体pEASY-Blunt Zero上，进行菌落PCR 和双酶切验证，经测序验证获得突变了PstI 位点完整Act2-1 启动子，见图2。

图1 Act2-1 启动子的克隆

图2 Act2-1 启动子序列

3.2 Ubi 启动子的改造及测序结果分析

Ubi 启动子全长2 035 bp，使用钝化酶切位点EcoR I 引物扩增两片段大小分别为1 415 bp、651 bp，回收两个片段作为模板，使用上下游引物第二轮扩增出Ubi 启动子全长，连接到克隆载体上挑选阳性克隆进行测序，获得突变EcoR I 酶切位点的Ubi 启动子。

3.3 黄色荧光瞬时表达载体构建及启动子启动荧光蛋白表达能力观察

利用In-Fusion 方法构建表达载体pACT-EYFP和pUBI-EYFP，大提质粒。与携带35s 启动子的对照载体一起瞬时转化到拟南芥原生质体，激光共聚焦显微镜下观察启动子是否能正常启动黄色荧光蛋白表达。对照35S::YFP 能够正常表达荧光蛋白，经克隆改造得到的Act2-1 和Ubi 启动子也均观测到黄色荧光蛋白，见图3，证明试验所得启动子具有启动蛋白表达功能。

图3 拟南芥原生质体瞬时表达黄色荧光蛋白

4 结论

根据NCBI 检索Os Actin2-1 序列，PCR 法克隆得到Actin2-1 启动子，与检索序列同源性达100%，在此基础上突变掉碍于下一步载体构建的酶切位点，得到新的Act2-1 启动子；在已有的玉米Ubiquitin 启动子基础上使用PCR 法突变掉EcoR I 酶切位点，使其便于下一步自有载体构建体系的应用。

使用拟南芥原生质体瞬时转化Act2-1、Ubiquitin启动子构建的黄色荧光瞬时表达载体，以黄色荧光蛋白基因作为报告基因，激光共聚焦显微镜下观察瞬时转化的原生质体，可观测到黄色荧光蛋白的表达，证明克隆得到的新启动子具有启动功能，可以用于单子叶植物表达载体的构建。