基于网络药理学探讨调脂通络胶囊防治心肌梗死的作用机制*

郑 佳，王永霞，胡宇才，朱智琦，任红杰，陈 鹏，乔利杰，李 彬

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是由冠状动脉短暂或永久性闭塞，心肌发生严重、持续的缺血缺氧引起局部坏死所导致的严重心血管疾病，是我国心血管疾病的重要致死因素之一[1]。据《中国心血管疾病与健康报告2020》要点解读[2]显示，2002—2018年急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的病死率总体呈上升态势，严重威胁人们的生命和健康。因此，如何有效防治MI迫在眉睫。目前，西医治疗MI主要以药物治疗、介入手术、冠状动脉内溶栓、冠脉搭桥为主，但各种手术治疗均存在不可预知的并发症。中医药在预防介入术后再狭窄、防治再灌注后无复流、改善患者临床症状、提高患者生活质量、增加活动耐量和改善患者远期预后等方面具有独特优势，已逐渐成为临床治疗心肌梗死的重要手段[3]。中医学认为，心肌梗死可归为“胸痹”“真心痛”范畴。《灵枢·厥病》曰：“真心痛，手足清至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死。”由此可知，该病为胸痹之重症。该病基本病机为气虚、寒凝、痰瘀痹阻，主要治则为益气温阳通络、活血祛痰。调脂通络胶囊是由河南中医药大学第一附属医院院内制剂调脂胶囊和冠心舒乐胶囊合方优化筛选而成，自1993年起运用于临床。相关实验研究[4-6]表明，调脂胶囊和冠心舒乐胶囊不但具有显著的抗动脉粥样硬化、调脂作用，而且在防治冠心病、心绞痛方面有很大优势。调脂通络胶囊是由上述两种药优化筛选出红参、红曲、三七、血竭、皂角刺5味中药组方，其防治冠心病心肌梗死的作用机制有待进一步的循证支持。笔者基于网络药理学分析调脂通络胶囊的活性成分及作用靶点，明确药物-活性成分-靶点-疾病之间的相互作用关系，继而系统揭示其治疗MI的药理机制，为进一步研究调脂通络胶囊防治MI提供新的研究思路及理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件使用

TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；TCMIP数据库(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)；PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；SwissTargetPrediction数据库(http://www.SwissTargetprediction.ch/)；Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)；Therapeutic Target Database数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)；DisGeNET数据库(http: //www.disgenet.org)；OMIM数据库((https://www.omim.org)；STRING数据库(https://cn.string-db.org/)；DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)；Veney 2.1软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；Cytoscape 3.7.2软件；OmicShare 基迪奥生物信息云平台(http://www.omicshare.com)。

1.2 调脂通络胶囊活性成分的获取及筛选

在TCMSP数据库中以“红参”“三七”“红曲”“皂角刺”“血竭”为关键词进行检索，获取相关的活性成分信息，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥18%为条件对活性成分进行筛选。未检索到活性成分的药物，通过TCMIP数据库及文献检索进行补充。在PubChem数据库中获取筛选后所得到的活性成分的标准Smiles结构。

1.3 调脂通络胶囊活性成分作用靶点的获取

使用活性成分的Smiles结构在SwissTargetPrediction数据库中对药物作用靶点进行预测，并以Probability≥0%为条件进行靶点筛选。将在SwissTargetPrediction数据库与TCMSP数据库中获得的药物靶点进行整合，得到所有的药物作用靶点。通过UniProt数据库对药物靶点进行标准化。

1.4 心肌梗死相关靶点的获取

在TTD数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库以“myocardial infarction”为关键词进行检索并整合，获取疾病相关靶点。

1.5 网络构建

将药物作用靶点与疾病靶点导入Venny 2.1软件中取交集，获取治疗MI的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。将潜在作用靶点导入功能蛋白缔合网络在线数据库STRING数据库，选择“multiple proteins”，种属设定为“homo sapiens”，进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，物种设置为“Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值为“highest confidence”(0.900)，隐藏游离点，构建蛋白-蛋白相互作用网络模型(PPI)，并导出string interactions数据，运用Cytoscape 3.7.2进行可视化。通过Cytoscape 3.7.2构建“药物-活性成分-靶点-疾病”调控网络。

1.6 基因本体(GO)生物过程分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

通过DAVID数据库对潜在作用进行GO富集分析及KEGG通路分析。以P<0.05作为筛选条件，获得GO富集分析结果和KEGG 通路分析结果，通过OmicShare绘制KEGG气泡图。

2 结 果

2.1 调脂通络胶囊活性成分筛选结果

通过TCMSP数据库及TCMIP数据库获得符合筛选标准的调脂通络胶囊的活性成分37个，其中红参4个、三七8个、皂角刺11个、血竭14个、红曲0个。经文献[7-8]补充后，获取红曲活性成分5个。去除重复值，共获得31个活性成分。其中度值较高的活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等。

2.2 调脂通络胶囊防治心肌梗死作用靶点的预测

将活性成分的Smiles结构导入SwissTargetPrediction数据库，设置条件为Probability≥0%，将所得靶点与TCMSP数据库中所得靶点合并，获得调脂通络胶囊所有靶点。检索TTD数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库，获得与心肌梗死相关的疾病靶点。将调脂通络胶囊所有靶点与疾病靶点导入Venny 2.1软件，最终获得潜在作用靶点138个，并绘制韦恩图，见图1。

图1 调脂通络胶囊-心肌梗死靶点韦恩图

2.3 调脂通络胶囊-心肌梗死蛋白质相互作用网络(PPI)

将上述获得的138个潜在作用靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，并利用Cytoscape 3.7.2进行可视化，见图2。该网络共有113个节点，348条边。面积越大，边越粗，代表 Degree 越高；Degree越高，表明该靶点与其他靶点的相关性越明显，在网络中越重要[9]。经排序，Degree 值排名前三的核心靶点分别为抑癌基因(TP53)、蛋白激酶(AKT1)、促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，这3个靶点在网络中与其他靶点的相关性明显，在整个调节网络中起到枢纽作用，可能是调脂通络胶囊治疗心肌梗死的关键靶点。

图2 调脂通络胶囊-心肌梗死蛋白质相互作用网络图

2.4 药物-活性成分-靶点-疾病网络的构建

将5种中药、31个活性成分、138个潜在作用靶点通过Cytoscape 3.7.2软件进行相连，绘制调脂通络胶囊-活性成分-靶点-心肌梗死相互作用网络图，见图3。其中三角形代表药物，六边形代表疾病，箭头代表活性成分，椭圆形代表靶点。图中可见多个靶点对应同一活性成分，一个靶点也可与多个活性成分相对应，表明调脂通络胶囊治疗心肌梗死具有多成分、多靶点的特点，也体现出中药方剂的复杂性与整体性。

图3 调脂通络胶囊-活性成分-靶点-心肌梗死相互作用网络图

2.5 GO功能富集分析

通过DAVID数据库对138个潜在靶点进行GO富集分析。GO富集分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3个部分，结果显示，富集到生物过程相关条目共548条，细胞组分相关条目共60条，分子功能相关条目共104条。根据富集基因数排序，选择GO富集分析的前10个结果用柱状图表示，见图4。由图4可知，GO富集分析主要涉及细胞因子介导的信号通路、基因表达的正向调控、凋亡过程的负调控等生物过程，胞质溶胶、细胞外空间、细胞外区等细胞组分，以及蛋白质结合、酶结合、锌离子结合等分子功能。

图4 调脂通络胶囊-心肌梗死共同靶点GO功能富集分析图

2.6 KEGG通路分析

通过DAVID数据库对138个潜在作用靶点进行KEGG通路分析，共富集到149条信号通路。选择KEGG通路分析中与心肌梗死密切相关的前20条，采用OmicShare绘制气泡图，见图5。由图5可见，显著性较高的通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化等。

图5 调脂通络胶囊-心肌梗死共同靶点KEGG通路分析图

3 讨 论

调脂通络胶囊由红参、三七、血竭、红曲、皂角刺5味中药组成，其中红参益气补脾、活血化瘀，三七散瘀止血、活血定痛，血竭活血化瘀、消炎止痛、收敛止血、软坚散结，红曲活血化瘀、健脾消食，皂角刺拔毒排脓、活血消肿。诸药合用，共奏活血化瘀、利湿化痰之效。现代药理学研究表明，红参中的化学成分人参皂苷 Rg1可通过提高氧自由基清除能力，抑制炎性因子表达，从而抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡[10]；人参皂苷Rb1还能显著增加抗凋亡蛋白的表达，降低促凋亡蛋白的表达，起到抑制心肌细胞凋亡的目的[11]。三七可降低血脂，预防动脉粥样硬化，降低血压，降低心肌收缩力和耗氧量，改善心肌供血情况，在冠心病的整个治疗过程中发挥一定的作用[12]。LI C等[13]研究显示，急性心肌梗死小鼠经血竭预处理后，白细胞介素-6(IL-6)、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导与转录因子3(p-STAT3)显著上调，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活，并调节其下游靶蛋白血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化物酶2(COX2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，促进心肌细胞增殖，调节心肌代谢，从而使心肌免受损伤。闫翔等[14]观察红曲改善老年冠心病患者颈动脉粥样斑块及血脂的疗效，结果显示，红曲可通过调控血脂、改善血管内皮功能，稳定颈动脉粥样硬化斑块，促进斑块逆转，从而减轻或防止冠状动脉硬化进展。范科华等[15]给予急性心肌梗死模型犬皂角刺提取物等药物灌肠，结果发现，皂角刺提取物可以改善模型犬的心脏舒张顺应性，降低急性心肌梗死后心脏舒张压及平均动脉压，增加 MI 后冠状静脉窦血氧含量，降低氧耗量，增强心肌细胞对缺氧的耐受，起到缩小心肌梗死范围的作用。虽然现代研究已对调脂通络胶囊各个组成成分的药理学作用进行了明确阐释，但调脂通络胶囊防治MI的作用机制仍有待明确。

笔者基于网络药理学对调脂通络胶囊治疗心肌梗死的作用机制进行系统研究，共发现调脂通络胶囊31个活性成分，其中度值较高的为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等。何亚磊等[16]研究表明，槲皮素可显著减轻心肌缺血再灌注损伤引起的心肌组织损伤，改善心脏功能，抑制心肌组织炎症反应和氧化应激反应。严宁等[17]发现，β-谷甾醇可能通过ERK1/2信号通路缓解心肌缺血再灌注大鼠出现的氧化应激和炎症损伤，并抑制其心肌细胞的凋亡。邹小艳等[18]探讨山柰酚对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型的保护作用及抑制脂代谢和细胞凋亡作用，结果发现，山柰酚可减轻心肌缺血再灌注损伤后心肌梗死面积，改善冠状动脉血流，减少心肌标志酶乳酸脱氢酶(LDH)的漏出，改善灌注后左心室收缩功能。据此推测，调脂通络胶囊可能主要通过以上成分发挥作用。

本次研究共预测到138个治疗MI的潜在靶点，其中，度值较高的为TP53、Akt1、MAPK1等。此外还存在B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)等与细胞凋亡相关的靶点。TP53是一种肿瘤抑制因子，研究[19-20]表明，TP53是维持心血管生理功能与病理过程的关键，可调节代谢与心脏结构相关蛋白的表达，还可通过抗血管生成、促凋亡、促自噬、促坏死调节心血管疾病的进展,在心肌缺血再灌注损伤和梗死后心室重构期间参与调节心肌细胞凋亡、自噬和坏死。Akt1是蛋白激酶B的一种亚型，与心血管系统关系密切，可调节心脏生长、冠状血管生成。研究表明，环形RNA可通过激活Akt1磷酸化和核易位减轻心肌损伤后心肌细胞凋亡，增强心脏修复能力[21]。MAPK1也称为细胞外信号调节激酶2，可通过纤维化信号级联蛋白影响心肌纤维化，调控细胞凋亡，保护心肌免受缺血再灌注损伤[22]。GO功能分析结果显示，调脂通络胶囊主要通过调控基因表达、细胞凋亡、缺氧等方面参与心肌梗死的治疗。KEGG通路富集分析结果显示，调脂通络胶囊主要通过脂质和动脉粥样硬化、流体剪切力和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-17(IL-17)、细胞凋亡、信号通路p53等信号通路发挥降脂、抗炎、抑制细胞凋亡的作用。目前认为，流体剪切力是动脉阻塞或严重狭窄后动脉生成的主要触发因素，可改善缺血组织血循环，促进血管新生[23-24]。国外研究[25]表明，体外心脏震波可以形成快速而短暂的剪切力，促使血管内皮生长因子上调、血管内皮细胞增殖、缺血组织中毛细血管新生，改善猪AMI模型的冠脉侧支循环。TNF信号通路是维持组织稳态和防止炎症病理的关键，与细胞存活和凋亡相关[26]。IL-17家族成员参与机体免疫调节，并且在不同的疾病中发挥着不同的作用。其家族包括6种细胞因子，分别为IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。其中，IL-17A是家族的原型，也是家族中最重要的炎症因子。研究[27]表明，IL-17A参与多种心血管疾病的发病过程，包括动脉粥样硬化、高血压病、病毒性心肌炎和扩张性心肌病等。细胞凋亡是指基于维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、程序性的死亡方式。心肌梗死发生时，心肌缺血缺氧，自由基大量生成、钙超载导致活性氧产生过多及清除不足，活性氧在体内积聚引起氧化损伤，最终导致心肌细胞凋亡。Bcl-2、Bax属于Bcl-2家族，是目前已知的细胞凋亡中最核心的两个基因。Bcl-2为凋亡抑制基因，可通过维持 Ca2+的动态平衡、拮抗促凋亡蛋白的表达和稳定细胞线粒体膜来抑制细胞凋亡[28]。Bax为促凋亡基因，可与Bcl-2形成异二聚体而启动信号通路，导致线粒体损伤，诱导细胞凋亡[29]。Bcl-2/Bax的比值决定了细胞凋亡的发生与否[30]。改善 Bcl-2和(或) Bax 蛋白表达，增加Bcl-2/Bax比值，可降低心梗后心肌细胞的凋亡率[31]。

本课题组前期探讨调脂通络胶囊对MI大鼠心功能及细胞凋亡相关基因的影响[32]，根据冠心病的发病机制建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨调脂通络胶囊防治心肌缺血再灌注损伤的可能药理学机制。研究结果显示，调脂通络胶囊能够改善血脂异常，降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)在血清中的含量，与阿托伐他汀具有等效性；同时能够改善心功能，抑制心肌凋亡，提高心肌梗死大鼠存活率，其作用机制可能与上调Bcl-2的表达、下调Bax的表达、上调Bcl-2/Bax的比值有关。此外，前期的基础研究[33-36]还证实，调脂通络胶囊可以抑制心肌梗死后血清中群体反应性抗体(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、心钠肽ANP、脑钠肽(BNP)、TNF-α、IL-6含量，延缓心室重构进程；可使LDH、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、内皮缩血管肽1(ET-1)含量均明显降低，缺血区心肌组织一氧化氮(NO)及内皮一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的含量明显升高，缩小心肌梗死范围，改善心肌病理形态，降低心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡率，对再灌注损伤的心肌有延迟保护作用。以上研究结论为调脂通络胶囊防治冠心病药物机制研究和临床运用提供了相应的实验依据，此与以上KEGG通路富集结果相一致。本研究基于网络药理学探讨调脂通络胶囊防治心肌梗死的作用机制，结果发现，调脂通络胶囊可能通过槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等多个活性成分，作用于TP53、Akt1、MAPK1、Bal-2、Bax等多个疾病靶点，通过脂质和动脉粥样硬化、流体剪切力和动脉粥样硬化、TNF、IL-17、细胞凋亡、信号通路p53等多个信号通路发挥降脂、抗炎、抑制细胞凋亡的作用。此结果不仅佐证了本课题组前期对调脂通络胶囊的研究结论，也为进一步研究调脂通络胶囊防治心肌梗死的药理机制提供了新的思路与方向。