苜蓿抗寒性对秋季施用钾肥种类及用量的生理响应

孙明雪，张玉霞，丛百明，夏全超，田永雷，张庆昕，杜晓艳

(1.内蒙古民族大学农学院/内蒙古自治区饲用作物工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028041；2.内蒙古自治区通辽市畜牧兽医科学研究所，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010010)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是被誉为“饲草之王”的多年生豆科牧草[1]，具有适应性强、营养价值高的特点，在世界各地种植面积超过3 000万公顷[2]。我国的苜蓿栽培面积在国家扶持政策和区域化农业布局优化调整的引导下，已达到377万hm2以上[3]，其中科尔沁沙地的苜蓿生产也得以快速发展，成为新兴苜蓿优势生产区[4-6]。紫花苜蓿作为多年生牧草翌年产量的高低取决于苜蓿根颈能否安全越冬[7-8]，而科尔沁沙地冬季温度低，昼夜温差大，降水少等气象特点都是限制苜蓿安全越冬的重要因素[9]。氮、磷、钾是维持植物生命活动最重要的大量元素[10-11]，其中钾元素是苜蓿维持生长发育的必要营养元素，钾肥既能促进碳水化合物的转运及蛋白质的合成[12-13]，又能调节植物气孔开闭，活化多种酶，提高植物抗逆性。钾肥种类及用量对苜蓿抗寒性的影响是否存在差异，如何通过调控水分含量及状态、含氮保护物质提高苜蓿抗寒性方面的研究尚少。为此，本研究采用大田试验对苜蓿进行秋季施用KCl和K2SO4两种钾肥的不同施用量处理，越冬前期挖取越冬材料采用低温冷藏和低温冷冻处理人工模拟低温处理，测定苜蓿根颈相对电导率、含水量及含氮保护物质变化，以期找到更经济有效的钾肥种类及用量，为科尔沁沙地生境下合理施用钾肥提高苜蓿抗寒性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古民族大学科技示范园区(43°36′N，122°22′E)。该地区属于温带半干旱大陆性气候，四季分明，降水集中，冬季漫长寒冷，降水少。年平均气温5.5℃，≥10℃年积温为3 000℃～3 200℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约375 mm，年平均风速3.0～4.4 m·s-1，土壤为透气性好、保水保肥较差、土壤温度变幅较大的沙壤土，土壤有机质含量为63.50 mg·kg-1，碱解氮含量34.95 mg·kg-1，全氮含量43.00 mg·kg-1，速效磷含量3.65 mg·kg-1，速效钾含量78.01 mg·kg-1。

1.2 供试材料

供试紫花苜蓿(M.sativa)品种为北极熊，由北京百斯特有限公司提供。供试肥料为K2SO4(K2O 50%)和KCl(K2O 60%)。

1.3 试验方法

1.3.1 大田试验设计 试验采用随机区组设计，于2018年7月2日播种北极熊苜蓿品种，播种量为22.5 kg·hm-2，行距为30 cm，小区面积为3 m×5 m=15 m2。播种前一次性施入过磷酸钙200 kg·hm-2为基肥。两个钾肥各设置5个处理：K0(不施钾)、K1(50 kg·hm-2)、K2(100 kg·hm-2)、K3(150 kg·hm-2)、K4(200 kg·hm-2)K2O，每个处理设置3次重复，共27个小区，均作为基肥一次性施入。试验田进行指针式喷灌，并正常进行杂草防除、病虫防治等管理。于封冻前期挖取长势一致的苜蓿越冬材料(包括根系、根颈、越冬芽)，带回室内进行低温处理。

1.3.2 低温处理试验 每个处理取50株长势均匀一致的苜蓿越冬材料，平均分成两份，1份放入4℃冰箱中储存(低温冷藏)，将另1份苜蓿根系用蒸馏水冲洗干净，整齐地排放在20 cm×30 cm的脱脂纯棉布上包裹好，后用3 mL蒸馏水均匀喷洒，使棉布保持湿润，最后用30 cm×30 cm的锡箔纸包裹好，放入可程式恒温恒湿试验箱进行-20℃低温处理(低温冷冻)。可程式恒温恒湿试验箱设置为：以4℃为起点，先以每小时4℃的速度降温，到达-20℃后保持6 h，后以每小时4℃的速度升温至4℃，取出后在4℃下放置12 h，与冷藏处理材料同时测定苜蓿根颈相对电导率、自由水、束缚水及游离氨基酸和脯氨酸含量。

1.4 测定指标及方法

相对电导率采用DDS电导率仪进行测定[14]，自由水和束缚水含量采用阿贝折射仪测定[15]，采用水合茚三酮法测定游离氨基酸含量[15]，采用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量[15]。

1.5 数据统计分析

试验数据用Microsoft Excel 软件处理、制作表格，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用二因素试验统计分析Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈相对电导率的影响

如表1所示，在4℃低温冷藏处理下苜蓿根颈的相对电导率，KCl肥在K2和K3处理下的相对电导率显著低于CK(P<0.05)，分别降低了19.73%和13.91%；K2SO4肥的相对电导率在各处理下均显著低于CK(P<0.05)，且在K3处理下达到最小值。在-20℃低温冷冻处理下，KCl和K2SO4肥处理苜蓿根颈的相对电导率较4℃处理分别增加了135.66%、153.22%、170.10%、129.70%、138.02%和135.66%、94.01%、53.39%、86.52%、143.52%，说明-20℃低温冷冻处理增加了细胞膜透性，使细胞外渗液增多。K2SO4肥在各施肥量处理下的相对电导率均显著低于KCl肥(P<0.05)，两种钾肥在K3和K4处理下的相对电导率均显著低于CK(P<0.05)，且在K3处理下最低，分别为较CK降低了16.09%和44.21%，说明施用钾肥有利于提高苜蓿抗寒性，且K2SO4肥优于KCl肥，施用量以150 kg·hm-2K2O为宜。

表1 不同钾肥处理苜蓿根颈在低温处理下的相对电导率变化/%Table 1 Changes in relative conductivity of alfalfa root necks cultured with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.2 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈自由水含量的影响

如表2所示，在4℃冷藏处理下苜蓿根颈的自由水含量，KCl肥在K3和K4处理下的自由水含量显著低于CK(P<0.05)，分别降低了17%和13%；K2SO4肥的自由水含量在各处理下均较CK无显著性差异。在-20℃处理下，KCl肥处理苜蓿根颈的自由水含量较4℃处理分别降低了11.94%、10.74%、21.59%、26.90%、13.95%，K2SO4肥处理苜蓿根颈的自由水含量较4℃处理分别降低了11.94%、10.62%、24.68%、51.34%、36.36%，说明-20℃处理下苜蓿根颈自由水含量降低；KCl肥在K2、K3和K4施肥量处理下的自由水含量显著低于CK(P<0.05)，分别降低了14.96%、31.89%和16.08%；K2SO4肥在K2、K3和K4处理下的自由水含量显著低于CK(P<0.05)，分别降低了12.26%、42.05%和28.88%；-20℃低温冷冻处理下K2SO4肥的自由水含量小于KCl肥(K2处理除外)，且在K3施用量处理下苜蓿根颈自由水含量达到最小值，说明施用适量的钾肥有利于降低苜蓿自由水含量，且K2SO4肥优于KCl肥，施用量为K3处理150 kg·hm-2K2O时，苜蓿根颈中自由水含量最低，细胞保水能力更强。

表2 不同钾肥处理苜蓿根颈在低温处理下自由水含量的变化/%Table 2 Changes of free water content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.3 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈束缚水含量的影响

如表3所示，在4℃处理下苜蓿根颈的束缚水含量，KCl各施肥量处理下的束缚水含量均显著高于CK(P<0.05)，且在K3下达到最大值；K2SO4的束缚水含量在K1、K3和K4施肥量处理下显著高于CK(P<0.05)，且在K3下达到最大值，较CK增加了50%。在-20℃处理下，KCl肥处理苜蓿根颈的束缚水含量较4℃处理分别增加了88.21%、4.89%、62.54%、55.02%、41.56%，K2SO4肥处理苜蓿根颈的束缚水含量较4℃处理分别增加了88.21%、16.30%、164.46%、150.94%、91.62%，说明-20℃低温处理下苜蓿根颈束缚水含量明显增加；KCl肥的K3施肥量处理下的束缚水含量显著高于CK(P<0.05)，增加了71.88%；K2SO4肥在K2、K3和K4处理下的束缚水含量显著高于CK(P<0.05)，分别增加了29.83%、93.37%和39.72%；K2SO4处理的束缚水含量均大于KCl处理下的束缚水含量，说明施用钾肥有利于增加苜蓿根颈中束缚水含量，且K2SO4优于KCl，K3处理的施用量为150kg·hm-2K2O，苜蓿根颈中束缚水含量最高。

表3 不同钾肥处理苜蓿根颈在低温处理下束缚水含量的变化/%Table 3 Changes of irreducible water content in the root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.4 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈自由水/束缚水的影响

如表4所示，4℃低温冷藏处理的苜蓿根颈的自由水/束缚水在KCl肥K3处理下最小，在K2SO4肥K1处理下最小。-20℃处理的苜蓿根颈的自由水/束缚水均较4℃处理明显减小，说明低温冷冻处理会使自由水/束缚水降低；K2SO4处理下自由水/束缚水小于KCl肥处理，且两种钾肥处理下的K3施肥量下自由水/束缚水最小，说明施肥量为150 kg·hm-2K2O最有利于促进苜蓿根颈束缚水含量的增加和自由水含量的降低，且K2SO4肥优于KCl肥。

表4 不同钾肥处理苜蓿根颈在低温处理下自由水/束缚水的变化Table 4 Free water/bound water changes of alfalfa root necks cultured with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.5 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈游离氨基酸含量的影响

如表5所示，在4℃冷藏处理下苜蓿根颈的游离氨基酸含量，KCl处理下的游离氨基酸含量在K1和K2施肥量下显著高于CK(P<0.05)，且在K2下达到最大值;K2SO4处理下的游离氨基酸含量在K1施肥量处理下显著高于CK(P<0.05)，较CK增加了23.74%。在-20℃低温处理下，KCl处理苜蓿根颈的游离氨基酸含量除K1处理外较4℃处理分别增加了10.07%、21.59%、50.32%、7.01%，K2SO4处理苜蓿根颈的游离氨基酸含量较4℃处理分别增加了10.07%、6.40%、54.78%、82.69%、21.77%，说明-20℃处理下苜蓿根颈游离氨基酸含量增加；KCl的K2、K3和K4施肥量处理下的游离氨基酸含量显著高于CK(P<0.05)，分别增加了39.87%、53.33%和9.80%；K2SO4肥在各施肥量处理下的游离氨基酸含量均显著高于CK(P<0.05)，分别增加了19.61%、58.82%和86.27%和16.99%；K2SO4肥处理的游离氨基酸含量在各施肥量处理下均大于KCl处理下的游离氨基酸含量，说明施用钾肥有利于增加苜蓿根颈中游离氨基酸含量，且K2SO4肥优于KCl肥，施用量以150 kg·hm-2K2O时，苜蓿根颈中游离氨基酸含量最高。

表5 施用不同钾肥苜蓿根颈在低温处理下游离氨基酸含量的变化/(mg·g-1)Table 5 Changes of free amino acid content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.6 不同钾肥种类及用量对苜蓿根颈脯氨酸含量的影响

如表6所示，4℃处理苜蓿根颈的脯氨酸含量，KCl肥处理的脯氨酸含量在K2、K3和K4施肥量下显著高于CK(P<0.05)，且在K3处理下达到最大值;K2SO4肥处理下的脯氨酸含量在K3和K4施肥量处理下显著高于CK(P<0.05)，较CK分别增加了20.71%和11.90%。在-20℃低温处理下，KCl肥处理苜蓿根颈的脯氨酸含量较4℃处理分别增加了18.10%、11.47%、3.09%、14.23%和1.71%，K2SO4肥处理苜蓿根颈的脯氨酸含量较4℃处理分别增加了18.10%、12.27%、29.67%、11.64%、3.40%，说明-20℃处理的苜蓿根颈脯氨酸含量增加；KCl肥的K3施肥量处理下的脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，增加了13.31%；K2SO4肥的K2和K3施肥量处理下的脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，分别增加了9.27%和14.11%；K2SO4肥处理的脯氨酸含量在各施肥量处理下均大于KCl肥处理下的脯氨酸含量。说明施用钾肥有利于增加苜蓿根颈中脯氨酸含量，且K2SO4肥优于KCl肥，施用量以K3施肥量处理的150 kg·hm-2K2O时，苜蓿根颈中脯氨酸含量最高。

表6 施用不同钾肥苜蓿根颈在低温处理下脯氨酸含量的变化/(μg·g-1)Table 6 Changes of proline content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.7 苜蓿根颈相对电导率与含水量和含氮保护物质含量的相关性

如表7所示，4℃处理下，自由水/束缚水与束缚水含量呈极显著负相关(P<0.01)，KCl肥处理下的自由水与束缚水含量、自由水/束缚水呈极显著负相关(P<0.01)；K2SO4肥处理的束缚水含量与脯氨酸含量呈显著正相关(P<0.05)。如表8所示，-20℃低温处理下，自由水/束缚水与束缚水含量呈极显著负相关(P<0.01)，与自由水含量呈极显著正相关(P<0.01)；KCl肥处理的相对电导率与脯氨酸含量呈显著负相关(P<0.05)；自由水含量与束缚水含量呈极显著负相关(P<0.01)，与游离氨基酸含量呈显著负相关(P<0.01)；束缚水含量与游离氨基酸、脯氨酸含量呈显著正相关(P<0.05)。-20℃低温处理下，K2SO4肥处理的相对电导率与游离氨基酸含量呈显著负相关(P<0.05)，自由水含量与束缚水含量呈极显著负相关(P<0.01)，束缚水含量与游离氨基酸含量呈显著正相关(P<0.05)，游离氨基酸含量与脯氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。说明苜蓿根颈束缚水含量、脯氨酸含量和游离氨基酸含量越高，相对电导率、自由水含量和自由水/束缚水越低，苜蓿细胞膜透性越低，苜蓿抗寒性越强。

表7 4℃处理下苜蓿根颈相对电导率与含水量和含氮保护物质含量的相关性Table 7 Correlation between relative conductivity and water content and nitrogen-containing protective substance content in root neck of alfalfa under 4℃ treatment

表8 -20℃处理下苜蓿根颈相对电导率与含水量和含氮保护物质含量的相关性Table 8 Correlation between relative conductivity and water content and nitrogen-containing protective substance content in root neck of alfalfa under -20℃ treatment

3 讨 论

植物受到低温胁迫时，细胞原生质结构会受到破坏，导致细胞膜透性增大，进而使电解质外渗液增多，相对电导率增大，因此相对电导率是反映植物受伤害程度及抗寒性强弱的重要指标之一[16-18]。

相对电导率越大，植物受伤害的程度越大。本研究结果表明，4℃低温冷藏处理下苜蓿根颈相对电导率明显低于-20℃冷冻处理。马娟娟等[19]的研究结果表明，随着低温胁迫强度的增加，北美冬青新品种苗木相对电导率呈上升趋势，与本研究结果一致；而-20℃低温冷冻处理下，随着施钾量的增加，相对电导率降低，且在施用量为150 kg·hm-2K2O(K3)下最低，说明适量的钾有利于减少电解质外渗，与游明鸿等[20]的研究结果一致。

植物细胞中的水分以自由水和束缚水两种状态存在[21]，自由水含量高时，植物代谢旺盛，抗寒性弱[22],束缚水含量高时，植物细胞生命代谢缓慢,细胞原生质粘稠性增加，冰点降低[12]。逆境条件下，植物自由水/束缚水降低，保水能力增强，维持细胞正常生命活动[23]。本研究结果表明，-20℃低温冷冻下的自由水含量与4℃冷藏处理下的相比明显降低，而束缚水含量明显增加。曹健冉[24]的研究结果表明，越冬期间软枣猕猴桃的自由水含量下降，束缚水含量有所上升，与本研究一致；而本研究中低温冷冻处理下施用钾肥可以显著降低自由水含量，增加束缚水含量，说明适量的钾肥有利于低温胁迫下束缚水含量的增加及自由水含量的减少，从而增加细胞液浓度，降低水溶液冰点，提高苜蓿抗寒性，其中以K2SO4施用量为150 kg·hm-2K2O(K3)最有利于提高苜蓿抗寒性。

脯氨酸和游离氨基酸是植物体内两种重要的非结构性含氮保护物质，游离氨基酸既是蛋白质分解的产物[25]，又是合成蛋白质的原料，游离氨基酸含量一定程度上可以反映氮代谢的情况；脯氨酸作为水溶性最大的氨基酸[26]，因其有强大的保水能力，能够调节细胞渗透势[27]，当植物受到逆境胁迫时，通常会积累大量脯氨酸。本研究结果表明，-20℃低温冷冻处理下的游离氨基酸含量与4℃处理下的相比有增加的趋势。朱爱民等[28]的研究表明，低温胁迫下苜蓿根颈中游离氨基酸含量增加，与本研究结果一致；-20℃低温冷冻处理下的游离氨基酸含量随着施钾量的增加有升高的趋势，但过量的钾又会使游离氨基酸含量下降，与程福皆等[13]的研究结果一致，可能的原因是，适量的钾能促进植物对氮素的吸收[29]，进而使游离氨基酸含量增加。本研究结果表明，-20℃低温冷冻处理下的脯氨酸含量随着施钾量的增加有升高的趋势，并且明显高于4℃处理下的脯氨酸含量，说明低温胁迫会使脯氨酸含量增加，并且适量的钾有利于脯氨酸的积累。研究表明施用150 kg·hm-2K2O的K2SO4最有利于提高苜蓿抗寒性，但过量的钾又会起抑制作用，可能的原因是，植物体内脯氨酸合成酶活性的增强和脯氨酸降解酶活性的降低会使脯氨酸含量增多，而钾作为植物体内多种酶的活化剂，过量的钾会抑制脯氨酸合成酶的活性，促进脯氨酸降解酶活性的增强[30]，并且过量的钾还会破坏细胞内渗透势的平衡，超出其自我调节能力，导致脯氨酸含量下降，其机理还有待进一步研究。

4 结 论

-20℃低温冷冻处理下苜蓿根颈相对电导率、束缚水含量、游离氨基酸含量和脯氨酸含量较4℃冷藏处理下增加，自由水含量、自由水/束缚水降低；且K2SO4肥处理束缚水含量、游离氨基酸和脯氨酸含量均高于KCl肥处理，自由水/束缚水低于KCl肥处理，说明K2SO4肥优于KCl肥；-20℃低温冷冻处理下，施用量为150 kg·hm-2K2O的K2SO4肥最有利于提高苜蓿抗寒性。因此建议在科尔沁沙地进行苜蓿生产，秋季施用K2SO4肥料150 kg·hm-2K2O促进苜蓿安全越冬。