尿素对蛋白激发子AMEP功能活性的影响

万恒东 岳文涛 赵 锋 商宪富 陈道文 王思文 孙明超刘 权*

（1黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319；2北大荒集团九三分公司红五月农场，黑龙江嫩江 161400）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种分布广泛的生防菌，能够分泌多种蛋白类和激素类活性物质，天然无毒害，是一种高效、经济、环保的微生物菌株，具有生长繁殖速度快、适应性强、抗逆性强、利于大量培养的优点[1]。随着绿色生态农业的发展，生物农药及肥料市场对枯草芽孢杆菌及其衍生产品的需求与日俱增[2]。

AMEP蛋白是从枯草芽孢杆菌BU412中鉴定的一种新型蛋白激发子，能够激发植物免疫系统，提高植物对病害的抗性[3]。高浓度的AMEP蛋白接种植物叶片会触发植物产生过敏反应。过敏反应是细胞死亡的一种形式，属于植物早期的防卫反应，是用来检验蛋白激发子功能活性的常用方法。

为了节省施用环节的成本，AMEP蛋白制剂在应用时应考虑与叶面肥混用，也是现阶段药肥一体化的趋势[4]。叶面肥是指向除作物根系以外的营养体表面施用的肥料，具有肥料利用效率高、用量少、养分吸收快、肥效好、针对性强、便于喷施等特点[5-6]。尿素不仅能够快速为植物提供氮源，而且对表皮细胞的角质层有软化作用，是叶面肥的主要成分之一[7-10]。但需要注意，尿素也是一种强力的蛋白质变性剂，能改变蛋白质分子的空间结构，使蛋白质变性[11]。尿素分子可与蛋白质分子上的羟基作用，打断蛋白质体系中的氢键，改变分子构象，暴露出非极性基团，β-折叠含量减少，无规则卷曲含量增加；肽链的某些片段会呈一定程度的伸展状态，使蛋白质分子的二级、三级或四级结构改变，即蛋白质分子发生变性[12-14]。由此可见，在AMEP蛋白制剂与叶面肥混用过程中，尿素对蛋白质变性的影响必须要重点考虑，以确保AMEP蛋白的功能活性不受影响。

本文从枯草芽孢杆菌中提取AMEP蛋白，经过一系列纯化后，设置了3个不同浓度的尿素对AMEP蛋白进行混合处理，通过过敏反应活性测试的方法探究了尿素浓度对AMEP功能活性的影响。本试验在确定最适尿素浓度后，通过灰霉菌接种试验检验了尿素与AMEP混用后对植物抗病性的影响，旨在为提高叶面肥利用率提供理论基础，也为今后AMEP蛋白制剂的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试烟草植株及菌株。供试烟草植株生长于24～26℃人工气候室，每天光照培养12 h，生长6周后的叶片用于过敏反应试验。

供试菌株为枯草芽孢杆菌BU412，由黑龙江八一农垦大学植物与微生物互作实验室分离并保存于中国模式菌种收集中心，用于AMEP的表达。灰霉菌菌株由黑龙江八一农垦大学植物与微生物互作实验室保藏，用于灰霉菌发病试验。

1.1.2 供试试剂。①酵母麦芽提取物液体培养基（YME）：麦芽糖 10 g/L、酵母提取物 4 g/L、葡萄糖4 g/L、pH值7.2，用于枯草芽孢杆菌BU412菌株的培养。②PDA固体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，用于灰霉菌的培养。③缓冲液：低盐缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，高盐缓冲液为 20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L NaCl。 ④尿素：国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 AMEP蛋白制备。①菌株培养。在超净环境中，挑取固体培养基上枯草芽孢杆菌BU412的单菌落，接种至5 mL YME液体培养基的试管中，在32℃、160 r/min条件下振荡培养12 h。将培养液按1∶100的比例接种至300 mL的YME液体培养基中，在32℃、160 r/min条件下振荡培养22 h。②蛋白纯化。菌液经11 000×g低温离心，时间为15 min，取上清液经0.22 μm膜过滤除杂，通过AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。先用HiTrap Q HP column（5 mL）进行第一步纯化，使用低盐缓冲液进行预平衡，将上清液上样至离子交换柱，上样完毕后使用低盐缓冲液平衡柱子，随后使用40%高盐缓冲液进行梯度洗脱，收集蛋白样品。第二步使用截留体积为30 kDa的Amicon超滤管对蛋白样品进行超滤，用低盐缓冲液反复超滤，舍去滤掉的样品，收集截留部分样品，即为AMEP蛋白样品。使用Nanodrop进行蛋白浓度测定，并调整蛋白质浓度至0.5 mg/mL。

1.2.2 过敏反应。本次试验以过敏反应程度作为检测指标，将AMEP中加入不同浓度的尿素进行单因素试验。在固定AMEP浓度和用量不变的条件下，采用单因素多水平试验设计方法，预先配制5 mg/mL尿素溶液（高浓度溶液），并对其稀释10倍（中浓度溶液）和100倍（低浓度溶液）。取1 mg/mL蛋白溶液100 μL分别与400 μL高、中、低浓度的尿素溶液混合，分别得到0.5 mL含高、中、低浓度尿素的蛋白溶液。随后通过无针注射器注射到烟草叶片背面，以同等浓度尿素溶液作为对照，24 h后检查注射部位的坏死斑现象，从而确定尿素对AMEP功能活性的影响。

1.2.3 灰霉菌发病试验。取培养6周的烟草叶片，喷施50 μg/mL AMEP蛋白与0.05 mg/mL尿素混合溶液进行免疫激活处理，以相同浓度尿素溶液作为对照。保湿2 d后，取灰霉菌块接种至烟草叶片背面，于28℃条件下保湿培养进行发病处理，3 d后观察灰霉病斑并拍照。

2 结果与分析

2.1 尿素对AMEP功能活性的影响

从图1可以看出，加入0.05、0.50、5.00 mg/mL等3个浓度尿素的AMEP均可使烟草叶片产生过敏反应，同等浓度尿素溶液的处理没有产生过敏反应。其中，0.05 mg/mL尿素使烟草叶片发生过敏反应的效果最好，随着尿素浓度的增加，过敏反应程度逐渐减弱。

2.2 尿素与AMEP混合液对灰霉病的影响

以灰霉菌感染烟草叶片，使烟草叶片发病，再喷洒50 μg/mL AMEP蛋白与0.05 mg/mL尿素混合溶液对烟草叶片进行免疫诱导，以相同浓度尿素为对照。由图2可知，喷洒0.05 mg/mL尿素与50 μg/mL AMEP蛋白混合液的烟草叶片能有效减轻烟草灰霉病的发病程度，而喷洒同浓度尿素溶液的叶片被灰霉菌感染，说明AMEP蛋白对灰霉菌有抑制作用。

3 结论与讨论

本试验通过过敏反应测试了不同浓度尿素对AMEP蛋白功能活性的影响，结果表明，0.05 mg/mL尿素使烟草叶片发生过敏反应效果最好，随着尿素浓度的增加，AMEP蛋白使烟草叶片发生过敏反应的程度减弱。由此判断，尿素浓度增加后，AMEP蛋白可能发生了变性，导致AMEP蛋白功能活性降低，从而减弱了过敏反应的程度。尹翠玉等[10]对大豆蛋白的脲变性及结构表征进行了研究，结果表明，不同浓度尿素使大豆蛋白变性的程度不同。本次试验结果与其研究结果相符，说明AMEP蛋白具备蛋白质的共同性质。张忠慧等[15]进行了大豆分离蛋白与低浓度尿素相互作用的红外光谱分析，结果表明：溶解在不同浓度尿素溶液中的大豆分离蛋白的二级结构与大豆分离蛋白的水溶液相比发生了很大的变化，在0.05 mg/mL尿素溶液中，大豆分离蛋白中的β-折叠含量最小，随着尿素浓度的增加，β-折叠的含量增加；无规则卷曲的含量在0.05 mg/mL尿素溶液中达到最大，之后随尿素浓度增加而降低；α-螺旋和β-转角的含量随着尿素浓度的增加呈现先增加后下降的趋势。以上研究均表明，高浓度尿素会对蛋白产生变性作用，对其功能活性产生极大的影响。

经过单因素试验筛选，确认AMEP蛋白能够与0.05 mg/mL尿素配伍使用，其活性不受影响。在过敏反应测试中，0.5 mg/mL AMEP蛋白与0.05 mg/mL尿素混合使用，能够有效诱导过敏反应出现。在灰霉菌发病试验中，50 μg/mL AMEP蛋白与0.05 mg/mL尿素混合处理烟草后，能有效降低灰霉病发病率。以上结果说明，0.05 mg/mL尿素与AMEP蛋白可共用，能顺利触发烟草防御反应诱导系统，增强烟草叶片对灰霉病的抗性，不会对其功能活性产生负面作用。

综上所述，尿素溶液在低浓度时，对AMEP蛋白的功能活性无负面作用；但当尿素浓度过高，AMEP蛋白的功能活性随着尿素浓度的增加而减弱。在实际生产过程中，叶菜类植物在苗期、中后期可喷施1%～2%尿素溶液，为植物提供充足的氮肥，防止叶片泛黄，加速植物生长。经换算，本试验确定的尿素使用浓度为0.05%，远低于叶面肥中尿素的常规用量。由此表明，蛋白类生物制剂在与叶面肥搭配使用时，应格外注意高浓度尿素对蛋白活性的影响。