微小RNA-588靶向调控脾酪氨酸激酶的表达及其对胃癌细胞增殖、凋亡的作用

2022-01-27张霓伍文才李春燕陈欣

安徽医药 2022年2期

张霓，伍文才，李春燕，陈欣

胃癌是消化系统恶性肿瘤，随着在分子水平上对胃癌的发生及进展机制的研究的不断深入，众多分子靶向药物的出现对晚期胃癌的治疗提供了良好的前景[1-2]。miRNA是一类内源性非编码小RNA，在转录后水平调控基因的表达，影响胃癌细胞的增殖、侵袭、转移及药物敏感性等[3]。研究发现miR-588高表达能显著抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移[4]；miR-588在肺鳞状细胞癌中低表达，与肿瘤分期和淋巴结侵袭呈负相关，miR-588过表达通过靶向GRN可抑制肺鳞状细胞癌的迁移和侵袭[5]。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）是信号转导蛋白，在细胞信号传导中起重要的作用，Syk在胰腺癌组织中低表达与胰腺癌的发生、发展有关[6]；Syk可抑制胃癌的生长和转移，诱导胃癌肿瘤细胞凋亡[7]。miR-588和Syk均与肿瘤的发生发展相关，但miR-588与Syk之间的调控关系尚不清楚，而且miR-588对胃癌增殖、凋亡的影响及可能的作用机制也不清楚，本研究自2019年1―5月研究miR-588对胃癌增殖、凋亡的影响以及用TargetScan在线软件预测miR-588是否与Syk存在靶向调控关系。

1 材料与方法

1.1 材料胃癌细胞SGC-7901、BGC-823和正常胃黏膜细胞GES-1均购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自美国Sigma公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒、凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体均购自北京博奥森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803和正常胃黏膜细胞GES-1用RPMI-1640培养基常规培养；取胃癌细胞BGC-823和MGC-803，将miR-NC、miR-588、anti-miR-NC和antimiR-588分别转染至细胞BGC-823和MGC-803中，记为miR-NC组、miR-588组、anti-miR-NC组和antimiR-588组；将anti-miR-588分别与si-NC和si-Syk共同转染至细胞BGC-823和MGC-803中，记为antimiR-588+si-NC组和anti-miR-588+si-Syk组，转染后的细胞继续培养48 h后用于实验，采取的是瞬时表达。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）检测miR-588表达水平提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按荧光定量试剂盒说明操作，以β-actin为内参进行PCR扩增，相对表达量用2−ΔΔCt法计算。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，封闭后加入一抗4℃孵育过夜；加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）室温孵育2 h，显影，定影，分析蛋白条带吸光度。

1.2.4 MTT检测细胞活性各组细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，酶标仪检测490 nm处吸光度值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组细胞，PBS漂洗2次，按试剂盒说明操作，加入Annexin VFITC和PI，最后上流式细胞仪检测。

1.2.6 双荧光素酶报告实验构建Syk野生型和突变型荧光素酶表达载体（WT-Syk和MUT-Syk），将其分别与miR-NC和miR-588共转染至BGC-823、MGC-803细胞，依据说明书要求检测细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-588在细胞 SGC-7901、BGC-823、MGC-803和GES-1中的表达胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803中miR-588的表达水平高于GES-1细胞[（0.58±0.06）、（0.84±0.08）、（0.97±0.10）比（0.36±0.04），F=89.59，P<0.05]。可见，在胃癌株中miR-588高表达。

2.2 抑制miR-588对细胞BGC-823、MGC-803增殖的影响与anti-miR-NC组相比，anti-miR-588组细胞BGC-823、MGC-803中miR-588表达水平降低，cyclin D1蛋白表达水平降低，P21蛋白表达水平升高，胃癌细胞活性降低（P<0.05）（图1，表1、2）。可见，抑制miR-588表达抑制细胞BGC-823、MGC-803的增殖。

图1 抑制miR-588对细胞BGC-823、MGC-803增殖相关蛋白表达的影响

表1 抑制miR-588对细胞BGC-823增殖的影响/±s

注：cyclin D1为细胞周期蛋白D1。

组别细胞活性（OD490 nm）72 h重复次数miR-588 cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值1.31±0.13 0.62±0.06 11.81 0.000 6 0 60.83±0.08.42±0.04 11.23 0.000 0.81±0.08 0.22±0.02 17.53 0.000 0.32±0.03 0.93±0.09 15.75 0.000 0.52±0.05 0.37±0.03 6.30 0.000 0.94±0.09 0.49±0.05 1.04 0.323

表2 抑制miR-588对细胞MGC-803增殖的影响/±s

注：cyclin D1为细胞周期蛋白D1。

组别anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值细胞活性（OD490 nm）72 h 1.31±0.13 0.57±0.06 12.66 0.000重复次数6 6 miR-588 0.96±0.10 0.35±0.03 14.31 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.15±0.01 20.05 0.000 P21蛋白0.32±0.03 1.06±0.10 17.36 0.000 24 h 0.52±0.05 0.31±0.03 8.82 0.000 48 h 0.94±0.09 0.42±0.04 12.93 0.000

2.3 抑制miR-588对细胞BGC-823、MGC-803凋亡的影响与anti-miR-NC组相比，anti-miR-588组胃癌细胞BGC-823、MGC-803中Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平和细胞凋亡率升高（P<0.05）（图2，表3，表4）。可见，抑制miR-588表达促进细胞BGC-823、MGC-803凋亡。

图2 抑制miR-588对细胞BGC-823凋亡蛋白表达的影响

表3 抑制miR-588对细胞BGC-823凋亡的影响/±s

注：Bax为Bcl相关X，Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2。

Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02 17.83 0.000 6 6组别anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36 16.87 0.000重复次数Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08 16.93 0.000

表4 抑制miR-588对细胞MGC-803凋亡的影响/±s

注：Bax为Bcl相关X，Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2。

组别anti-miR-NC anti-miR-588 t值P值凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76 15.85 0.000重复次数6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01 21.82 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09 18.33 0.000

2.4 miR-588靶向、调控Syk 将Syk用TargetScan在线软件预测其可能的作用靶点，结果显示Syk与miR-588存在结合位点（图3A）。miR-588与WT-Syk共转染的胃癌细胞BGC-823、MGC-803荧光素酶活性显著降低（P<0.05）（表5）。Western Blot检测结果（图3B，表6）显示，miR-588组BGC-823、MGC-803中Syk蛋白的表达水平显著miR-NC组；anti-miR-588组胃癌细胞BGC-823、、MGC-803中Syk蛋白的表达水平显著高于 anti-miR-NC组（P<0.05）。可见，miR-588可靶向调控Syk的表达。

图3 miR-588靶向调控Syk：A为Syk与miR-588的互补序列；B为miR-588调控Syk的表达

表5 双荧光素酶报告实验/±s

注：Syk为脾酪氨酸激酶。

重复次数组别MUT-Syk WT-Syk miR-NC miR-588 t值P值6 6 0.99±0.09 1.01±0.10 0.36 0.723 0.96±0.09 0.47±0.04 12.19 0.000

表6 miR-588调控Syk的表达/±s

注：Syk为脾酪氨酸激酶。①与miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-NC组比较，P<0.05。

MGC-803 Syk蛋白0.15±0.01 0.03±0.01①0.17±0.01 0.62±0.06②413.28 0.000组别miR-NC miR-588 anti-miR-NC anti-miR-588 F值P值重复次数6 6 6 6 BGC-823 Syk蛋白0.16±0.01 0.05±0.01①0.15±0.01 0.48±0.05②298.86 0.000

2.5 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用与antimiR-588+si-NC组相比，anti-miR-588+si-Syk组胃癌细胞BGC-823和MGC-803中cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，P21、Bax、Syk蛋白的表达水平显著降低，胃癌细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低（P<0.05）（图4，表7～10）。可见，抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823和MGC-803增殖、凋亡的作用。

图4 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823、MGC-803增殖、凋亡蛋白表达的影响

表7 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823增殖的抑制作用/±s

注：Syk为脾酪氨酸激酶，cyclin D1为细胞周期蛋白D1。①与anti-miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-588+si-NC组比较，P<0.05。

组别anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值72 h 1.31±0.13 0.62±0.06①0.61±0.06 0.98±0.09②83.33 0.000214重复次数6 6 6 6 Syk蛋白0.13±0.01 0.46±0.04①0.48±0.04 0.29±0.03②153.52 0.000 cyclin D1蛋白0.81±0.08 0.22±0.02①0.21±0.03 0.54±0.05②194.59 0.000 P21蛋白0.32±0.03 0.93±0.09①0.91±0.09 0.65±0.06②94.25 0.000细胞活性（OD490 nm）24 h 0.52±0.05 0.37±0.03①0.35±0.03 0.45±0.04②24.78 0.000 48 h 0.94±0.09 0.49±0.05①0.47±0.05 0.69±0.07②63.86 0.000

表8 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞MGC-803增殖的抑制作用/±s

注：Syk为脾酪氨酸激酶，cyclin D1为细胞周期蛋白D1。①与anti-miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-588+si-NC组比较，P<0.05。

组别细胞活性（OD490 nm）重复次数72 h Syk蛋白cyclin D1蛋白P21蛋白24 h 48 h anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值1.31±0.13 0.57±0.06①0.59±0.06 1.03±0.10②90.91 0.000 6 6 6 6 0.13±0.01 0.58±0.06①0.60±0.06 0.28±0.03②155.78 0.000 0.81±0.08 0.15±0.01①0.13±0.01 0.64±0.06②279.90 0.000 0.32±0.03 1.06±0.10①1.04±0.10 0.55±0.05②138.42 0.000 0.52±0.05 0.31±0.03①0.30±0.03 0.46±0.04②48.92 0.000 0.94±0.09 0.42±0.04①0.43±0.04 0.73±0.07②93.93 0.000

表9 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823凋亡的促进作用/±s

注：①与anti-miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-588+si-NC组比较，P<0.05。

重复次数6 6 6 6 Bax蛋白0.26±0.02 0.83±0.08①0.81±0.08 0.56±0.06②101.57 0.000组别anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.22±0.02①0.21±0.02 0.47±0.04②214.00 0.000凋亡率/%7.64±0.75 24.69±2.36①24.86±2.37 14.58±1.23②127.18 0.000

表10 抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞MGC-803凋亡的促进作用/±s

注：Bax为Bcl相关X，Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2。①与anti-miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-588+si-NC组比较，P<0.05。

凋亡率/%7.64±0.75 26.15±2.76①26.36±2.47 12.58±1.26②137.57 0.000组别anti-miR-NC anti-miR-588 anti-miR-588+si-NC anti-miR-588+si-Syk F值P值重复次数6 6 6 6 Bcl-2蛋白0.75±0.07 0.12±0.01①0.14±0.01 0.58±0.06②276.67 0.000 Bax蛋白0.26±0.02 0.95±0.09①0.94±0.09 0.41±0.04②168.53 0.000

3 讨论

胃癌的发病率和死亡率较高，手术结合放化疗仍是其治疗的主要方法，但化疗药物的不良反应和耐药性导致患者治疗及预后不佳，特定分子靶向药物具有不良反应少、耐药率低等优点成为治疗晚期胃癌的新手段[8]。大量研究表明miRNAs在胃癌中的异常表达与胃癌的进展及预后相关，可作为胃癌早期诊断、预后的标志物和治疗的靶点[9]。miR-588在人前列腺癌中上调表达，与患者预后和存活率密切相关，miR-588下调表达显著抑制前列腺癌细胞增殖[10]。而miR-588在乳腺癌中下调表达，miR-588上调表达可抑制乳腺癌细胞增殖，增加顺铂化学敏感性[11]。miR-588还参与调控乳腺癌的PTX耐药性[12]。王金申利用miRNA芯片技术筛选出在胃癌中差异表达的miRNA，发现miR-588在胃癌中上调表达[13]。本研究结果表明，胃癌细胞中miR-588高表达，抑制miR-588表达促进P21、Bax蛋白的表达，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达；还可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

Syk是一种潜在的抑癌基因，Syk基因启动子超甲基化是其沉默的机制之一，Syk的低表达与肿瘤增生及浸润转移相关[14]。研究发现天花粉蛋白通过逆转Syk基因启动子CpG岛的甲基化，可抑制喉癌细胞Hep-2的增殖、侵袭迁移[15]；Syk抑制剂可减弱血管平滑肌细胞的增殖和迁移[16]。在胃癌细胞中Syk低表达，高表达抑制胃癌细胞的生长和转移，诱导胃癌组织肿瘤细胞凋亡[17]；芦丁联合奥沙利铂通过激活FKN/SYK/p38通路促进胃癌细胞凋亡[18]。此外，Syk还可通过被miRNA调控影响肿瘤的进展，如Syk是miR-146a的直接靶标，且影响急性髓性白血病小鼠的存活[19]。本实验结果发现miR-588可负调控Syk表达。

cyclinD1是细胞周期蛋白，cyclinD1高表达促进细胞增殖，而p21是一种新的抑癌基因，高表达抑制细胞增殖[20-21]。Bax和Bcl-2是凋亡相关蛋白，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抗凋亡因子[22]。抑制miR-588表达促进P21、Bax蛋白的表达，抑制cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达；说明抑制miR-588表达抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。而同时抑制Syk和miR-588的表达可以促进cyclinD1、Bcl-2蛋白的表达，抑制p21、Bax的表达，说明抑制Syk表达能逆转抑制miR-588对细胞BGC-823的作用。进一步说明，miR-588可以调控Syk表达，且miR-588调控Syk进而通过调控增殖及凋亡相关蛋白的表达影响胃癌细胞的增殖和凋亡。

综上所述，miR-588能抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与上调Syk有关。