酒精性肝炎病人血清微小核糖核酸-182和微小核糖核酸-30e检测及临床意义

2022-01-27李艺明邓倩曦

安徽医药 2022年2期

李艺明，邓倩曦

酒精性肝炎是指长期过量饮酒所致的肝脏炎症反应性疾病，可随着疾病的发展出现肝硬化、肝衰竭等，危害甚重。据统计[1]，我国酒精性肝病的患病率约为4.34%，其中酒精性肝炎、酒精性肝硬化分别为1.51%、0.68%，且酒精性肝炎伴肝硬化病人预后差，5年生存率仅为40%左右，因此需对酒精性肝炎病人明确诊断、及早治疗。当前临床上常用的酒精性肝炎指标主要包括肝功能、肝纤维化指标等，但均缺乏特异性，且临床意义有限。微小核糖核酸（miR）-182定位于人类7号染色体（7q32.2），可与miR-96、miR-183形成基因簇，可以调节生物体的生长、发育及分化，并且与视力、听力和中枢神经系统障碍等疾病发生关系密切[2-3]。研究指出[4]，miR-182与酒精依赖有相关性，且与肝细胞癌、肝硬化等也有紧密关联。miR-30e可靶向调控自噬相关基因，与生物体的代谢、肿瘤的生长等均有密切关联。有研究指出[5]，非酒精性脂肪肝病人中外周血miR-30e水平偏低，且对肝癌也有诊断价值。但目前关于酒精性肝炎病人血清miR-182和miR-30e水平检测及意义尚鲜有报道。为探讨上述问题，本研究分别对98例酒精性肝炎病人和89例健康志愿者的资料展开回顾性分析，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2019年10月绵阳市第三人民医院收治的酒精性肝炎病人98例为观察组，选取同时间段绵阳市第三人民医院体检中心体检的健康志愿者89例为健康对照组。观察组男81例、女17例，年龄（45.26±8.46）岁，范围为33～68岁，体质量指数（22.14±2.16）kg/m2，范围为17.65～27.85 kg/m2，其中有27例并发酒精性肝硬化，肝硬化代偿期20例、失代偿期7例，其中初诊21例，所有病人均接受常规保肝、护肝治疗；健康对照组男76例、女13例，年龄（46.75±9.05）岁，范围为30～70岁，体质量指数（22.16±2.14）kg/m2，范围为17.61～27.89 kg/m2。两组性别、年龄及体质量指数比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：①观察组均符合《酒精性肝病诊断标准》中酒精性肝炎的诊断标准[6]，健康对照组均为健康志愿者；②均检测外周血血清miR-182和miR-30e水平；③均对本研究知情同意，签署知情同意书。排除标准：①原发性或转移性肝癌、肝血管瘤等其它类型肝病者；②合并乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤者；③存在其它类型可能与miR-182和miR-30e异常表达有关的疾病者，如视力、听力和中枢神经系统障碍等；④存在认知、精神、沟通等方面障碍者。

1.3 血清miR-182和miR-30e水平检测（1）试剂和仪器：美国Beckman Coulter公司Avanti型台式离心机、日本三洋公司MDF-U54V型医用超低温冰箱，美国Invitmgen公司miR easy Mini kit试剂盒，美国GeneCopoeia公司miR逆转录试剂盒，美国Bio-Rad公司SC46-T100型PCR仪；（2）检测方法：取外周血各5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液保存于-80℃的医用超低温冰箱中。利用miR easy Mini kit试剂盒抽提血清RNA，并采用miR逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，合成相应的Taqman荧光探针。以PCI仪进行扩增反应，其中miR-182引物序列正向引物：GCGCTGCTAGACTCTCTGAAT，反向引物：GCTCGATAGCTATTAGCTATAGCTA；miR-30e引物序列正向引物：CGATATAGACTAGCTAGAGAGCTAG，反向引物：CGTGATAGAGAGCTAGAGCGCGCGATAGC，内参为U6，引物均根据GenBank人类信息利用Primer5.0软件设计，委托宝生物（大连）科技有限公司合成。反应条件：95℃10 min（预变性）、95 ℃20 s（变性）、58 ℃60 s（退火）、72 ℃40 s（延伸），40个循环。绘制PCR曲线，得到Ct值，即荧光强度达到的阈值所需的循环数，待测基因的相对表达量计算方法：2-△△Ct。

1.4 观察指标比较观察组与健康对照组及观察组中未并发酒精性肝硬化、并发酒精性肝硬化、酒精性肝硬化代偿期、酒精性肝硬化失代偿期病人血清miR-182和miR-30e水平。

1.5 统计学方法数据处理以SPSS 25.0软件，采用±s描述计量资料，两独立样本间均数的比较采用成组t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和健康对照组血清miR-182和miR-30e水平对比观察组血清miR-182和miR-30e水平均低于健康对照组（P<0.05），见表1。

表1 观察组和健康对照组血清miR-182和miR-30e水平对比/±s

组别健康对照组观察组t值P值例数89 98 miR-182 0.65±0.12 0.21±0.04 34.27<0.001 miR-30e 1.58±0.25 0.41±0.08 43.93<0.001

2.2 观察组中是否并发酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平对比观察组中并发酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平均低于未并发酒精性肝硬化病人（P<0.05），见表2。

表2 观察组中是否并发酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平对比/±s

并发肝硬化是否t值例数27 72 P值miR-182 0.13±0.03 0.24±0.05 10.71<0.001 miR-30e 0.29±0.04 0.45±0.10 8.06<0.001

2.3 并发酒精性肝硬化代偿期、失代偿期病人血清miR-182和miR-30e水平对比并发酒精性肝硬化失代偿期病人血清miR-182和miR-30e水平均低于代偿期病人（P<0.05），见表3。

表3 并发酒精性肝硬化代偿期、失代偿期病人血清miR-182和miR-30e水平对比/±s

并发酒精性肝硬化失代偿期代偿期t值P值例数7 20 miR-182 0.06±0.02 0.15±0.04 5.66 0.000 miR-30e 0.13±0.03 0.35±0.05 10.89 0.000

3 讨论

酒精性肝炎主要由于长期过量饮酒所致，且与个体对乙醇的敏感性有关。研究指出[7-9]，长期饮酒不仅可引起肝脏内良性脂肪堆积，还可增加肝组织铁负荷量，引起机体防御机制失调，诱导氧化应激和脂质过氧化损伤，诱发炎症和纤维环，在“初次打击”和“二次打击”的作用下可导致肝脏炎症反应损害，损伤肝脏细胞的结构和功能。酒精性肝炎病人若得不到及时诊治，可发展为酒精性肝硬化，增加死亡几率，尤其是在酒精依赖、成瘾病人中酒精性肝硬化和死亡的发生风险均更高[10]。但目前人们对酒精性肝炎及酒精性肝硬化的发生和发展认识尚浅，而miR在此类疾病中的异常表达及作用机制虽有少量报道，也仍需要继续深入探讨。

miR-182已均被证实在原发性肝癌病人中表达水平偏低，且与病情程度、肝功能均有密切关系[11]。miR-182可以与靶基因的启动子、5’UTR结合发挥作用，其作用复杂，且基因簇也很多，在细胞增殖、发育、分化、代谢和凋亡过程中均积极参与且发挥重要的作用。有研究显示[12]，慢性低浓度酒精摄取可以下调小鼠小脑miR-182的表达水平，且可引发酒精依赖，并诱导中枢神经系统炎症反应损害，甚至可导致认知功能障碍，推测该基因表达有助于位置神经元的正常结构和功能，而长期过量饮酒可通过下调该基因的表达从而诱导炎症性损伤。因此miR-182在酒精性肝炎病人中的表达水平也可能显著下调，且参与肝脏结构与功能的损害，影响肝功能，但是其作用机制均尚未清楚，仍需深入探讨和挖掘。本研究中观察组血清miR-182的水平明显低于健康对照组，提示酒精性肝炎病人中血清miR-182水平较低。此外，本研究中还显示并发酒精性肝硬化病人的血清miR-182水平低于未并发病人，且失代偿期病人血清miR-182水平低于代偿期病人，可知酒精性肝炎病人血清miR-182水平很可能与疾病发展有关，推测很可能是长期过度饮酒导致miR-182表达水平下调，进而诱导肝细胞损伤，且其水平表达水平越低，肝细胞炎症反应性损伤越严重，肝功能损害也越严重，故而并发酒精性肝硬化的风险越高，病情进展也越快。

miR-30e是miR-30的一个重要成员，可通过碱基互补配对方式与靶基因相结合，抑制靶基因的表达，进而调控细胞的生长、增殖、分化与凋亡，最终可实现调控机体生长发育和代谢的作用[13]。miR-30e在心血管系统、代谢性疾病以及肿瘤的发生和发展过程中均扮演着重要的角色，其主要作用机制有诱导细胞自噬、诱导氧化应激反应、调控脂肪细胞形成等，在炎症反应病理改变中也发挥着重要的作用[14]。有研究显示[15]，miR-30e可协同其家族成员共同参与肝脏炎性损伤的发生和进展，在肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌病人中均发现其表达水平显著下调。另有研究[16]显示血清miR-30e低表达可参与慢性肝病的发生和发展，且其水平越低意味着肝脏损伤越严重，病人的预后则越差。据此可以推测miR-30e很可能能够通过多种途径参与肝损伤病理改变，在酒精性肝炎发生及发展过程中也可能通过影响肝脏内脂肪细胞的形成与积聚、肝细胞的炎症性损伤和肝脏的代谢功能等发挥重要作用。本次研究中观察组血清miR-30e水平远低于健康对照组，提示酒精性肝炎病人血清miR-30e水平普遍偏低。此外，本研究中观察组并发酒精性肝硬化病人血清miR-30e水平低于未并发病人，且酒精性肝硬化失代偿期病人血清miR-30e水平低于代偿期病人，可知该指标不仅可评价酒精性肝炎的发生情况，对是否并发酒精性肝硬化、酒精性肝硬化的临床分期判断也有一定的指导作用，但其中具体的作用机制仍有待深入探讨。

综上，在酒精性肝炎病人中血清miR-182、miR-30e水平较健康人群偏低，且并发酒精性肝硬化病人中其水平更低，酒精性肝硬化失代偿期其水平也明显低于酒精性肝硬化代偿期病人，二者水平与该病的发生和发展有密切关系。但目前人们关于miR-182、miR-30e异常表达参与该病发生和发展的具体机制认识尚浅，仍需深入探讨研究，以期为该病的防治提供新的方向。