微小RNA-766-5p通过调控组氨酸磷酸酶基因表达影响胃癌细胞增殖和放射敏感性

刘国成，官一平，王成，黄国军

放疗是胃癌（gastric cancer）的治疗手段之一，可优化病人预后，放疗耐受是临床放疗的主要障碍[1]，γ-H2AX含量升高是放疗耐受的标志之一[2-3]。研究胃癌的放疗耐受机制有助于发现其放疗增敏靶点，从而减轻病人痛苦、提高治疗效果。

研究表明，miR-766-5p在结直肠癌组织中表达上调，抑制miR-766-5p可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡[4]。miR-766-5p在胃癌中的表达尚不清楚。生物信息学分析发现，组氨酸磷酸酶（phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP）的 3’UTR 区含有与miR-766-5p互补的序列，LHPP在人宫颈癌组织中表达降低，LHPP过表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭[5]。而miR-766-5p和LHPP在胃癌中的表达及胃癌细胞增殖、放射敏感性的影响尚未可知。因此，假设miR-766-5p可通过靶向LHPP基因影响胃癌细胞的增殖和放射敏感性。

本研究自2019年2―10月通过以不同放射剂量处理胃癌AGS细胞，检测miR-766-5p和LHPP在AGS细胞中的表达及对AGS细胞增殖和放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料人胃上皮细胞GES-1及人胃癌细胞系AGS、MGC803、MKN-28和 SGC-7901购 自 美 国ATCC；LHPP抗体、CyclinD1抗体、γ-H2AX抗体和抗β-actin抗体购自Abcam公司；DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；Total RNA提取试剂盒、real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（RT-PCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；引物、miR-766-5p模拟物（miR-766-5p）、miR-766-5p抑制剂（antimiR-766-5p）、LHPP干扰物（si-LHPP）、阴性对照（miR-con、anti-miR-c006Fn和 si-con）及 LHPP双荧光报告质粒购自上海吉玛制药有限公司；BCA蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人胃上皮细胞GES-1及人胃癌细胞系AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901培养于含10%FBS和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基，在湿度95%、37℃5%二氧化碳培养箱中常规培养。待细胞生长融合为80%时，洗涤，胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞转染 收集AGS对数生长期细胞，接种于6孔板（密度为1×l06个/毫升），以不转染的细胞为空白对照（NC）组。细胞融合度达80%时，根据Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行操作，将等体积用无血清培养液稀释的脂质体和各组载体（antimiR-con、anti-miR-766-5p、miR-con、miR-766-5p、sicon和si-LHPP）混合，继续培养6h，换成完全培养基，转染48h收集细胞，验证转染结果，进行后续实验。根据转染分组：空白对照NC组、anti-miR-con组、anti-miR-766-5p组、miR-con组、miR-766-5p组、antimiR-766-5p+si-con组、anti-miR-766-5p+si-LHPP组。

1.2.3 Real-time PCR检测RNA的表达 收集人胃上皮细胞GES-1及人胃癌细胞系AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901及转染48 h的AGS细胞，进行总RNA的提取，然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA，取cDNA为模板进行Real-time PCR反应，合成 LHPP mRNA 和 miR-766-5p。运用 2−ΔΔCt法进行数据分析，以β-actin为内参照进行校正。

1.2.4 克隆形成实验测定放射处理后细胞存活分数 取转染后各组AGS细胞，接种于6孔板（1×104个细胞/孔），培养24 h，将细胞在射剂量为0、2、4、6、8 Gy进行照射处理，照射条件为37℃，照射面积10 cm×10 cm，靶距100 cm。照射后每组取500个细胞接种于培养皿中，加入10 mL培养液混匀，培养2周，至出现肉眼清晰可见的细胞克隆，弃培养液并洗涤细胞，4%冷甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色30 min，晾干后计数，以所形成的细胞集落>50个为有效菌落。根据GraphPad Prism5单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比（SER）。计算细胞克隆形成率=（细胞克隆数平均值/接种细胞总数）×100%，细胞存活分数（survival fraction，SF）=受照射细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率）×100%。

1.2.5 MTT法测定细胞存活率 收集各组对数生长期的AGS细胞，接种于96孔板中（1×103个细胞/孔），以不加细胞的培养液为空白对照，72h后每孔加入20 μL MTT，培养4 h弃培养上清，每孔再加入150 μL DMSO，酶标仪测定490 nm 吸光度（A）值。细胞存活率=（A实验组－A空白对照组）/（A阴性对照组－A空白对照组）×100%。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达 RIPA裂解液加入GES-1细胞和各组胃癌细胞，收集蛋白，测定总蛋白浓度。取蛋白样品进行SDSPAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗稀释液（LHPP抗体1∶800、CyclinD1抗体1∶1 000、γ-H2AX抗体1∶1 000、β-actin抗体1∶2 000），4 ℃孵育过夜，加入稀释的酶标二抗，室温孵育1 h。以β-actin为内参照，分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法数据分析采用SPSS 19.0统计软件进行，结果以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，用LSD法进行两组间的比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞系中miR-766-5p和LHPP的表达与GES-1相比，miR-766-5p在胃癌细胞AGS、MGC803、MKN-28、SGC-7901表达量均显著上升（P<0.05），LHPP mRNA和蛋白的表达量显著下降（P<0.05），见表1。后续实验选择AGS细胞进行研究。

表1 胃癌细胞系中miR-766-5p和LHPP的表达/±s

表1 胃癌细胞系中miR-766-5p和LHPP的表达/±s

注：①与GES-1细胞组比较，P<0.05。

组别GES-1 AGS MGC803 MKN-28 SGC-7901 F值P值LHPP protein 1.08±0.12 0.45±0.05①0.35±0.05①0.30±0.04①0.46±0.05①63.68 0.000重复次数3 3 3 3 3 miR-766-5p 1.00±0.10 3.30±0.24①2.89±0.19①2.05±0.21①1.99±0.19①64.89 0.000 LHPP mRNA 4.46±0.25 0.85±0.09①1.01±0.11①0.75±0.08①0.99±0.10①385.37 0.000

2.2 转染anti-miR-766-5p抑制胃癌细胞系AGS增殖与NC组相比，anti-miR-766-5p组细胞中miR-766-5p表达量降低（P<0.05），LHPP mRNA和蛋白表达量显著上升（P<0.05），CyclinD1表达降低（P<0.05），γ-H2AX表达增多（P<0.05），细胞存活率显著下降（P<0.05），具有统计学意义。表明抑制miR-766-5p表达可抑制AGS细胞增殖。见表2。

表2 转染anti-miR-766-5p对AGS胃癌细胞增殖和相关蛋白表达的影响/±s

表2 转染anti-miR-766-5p对AGS胃癌细胞增殖和相关蛋白表达的影响/±s

注：①与NC组比较，P<0.05。

组别细胞存活率/%重复次数miR-766-5p LHPP CyclinD1γ-H2AX NC anti-miR-con anti-miR-766-5p F值P值100.00±5.16 100.03±3.08 63.49±0.06①110.82 0.000 3 3 3 3.38±0.26 3.40±0.25 1.00±0.10①122.32 0.000 0.42±0.05 0.45±0.05 1.12±0.12①72.67 0.000 1.15±0.11 1.13±0.12 0.45±0.05①49.28 0.000 0.85±0.09 0.88±0.09 1.35±0.14①19.77 0.002

2.3 转染anti-miR-766-5p增加AGS细胞放射敏感性与对照NC相比，anti-miR-766-5p组细胞存活分数随放射剂量的增加呈下降趋势，放射增敏比为1.72。见表3。说明抑制miR-766-5p表达可提高胃癌AGS细胞的放射敏感性。

表3 转染anti-miR-766-5p联合X射线照射对AGS胃癌细胞作用的单击多靶模型的参数值

2.4 miR-766-5p靶向调控LHPP的表达通过TargetScan对miR-766-5p和LHPP结合进行预测显示，LHPP的3’-UTR序列中含有与miR-766-5p互补的核苷酸序列。

构建含有miR-766-5p结合位点的LHPP-3’UTR野生型及突变型报告基因载体，在AGS细胞中转染miR-766-5p mimics和LHPP野生型及突变型报告基因载体，与miR-con组相比，miR-766-5p组LHPP WT荧光素酶活性降低[（0.40±0.05）比（1.05±0.15），P<0.05]，而突变型MUT荧光素酶活性无变化。与miR-con组相比，miR-766-5p组的LHPP蛋白表达量显著下降[（0.16±0.03）比（0.45±0.04），P<0.05]；与anti-miR-con组相比，anti-miR-766-5p组的LHPP蛋白表达量显著上升[（1.10±0.12）比（0.42±0.05），P<0.05]。说明miR-766-5p靶向负调控LHPP的表达。

2.5 敲减LHPP可以逆转anti-miR-766-5p对AGS细胞增殖和放射敏感性的影响与对照anti-miR-con组相比，anit-miR-766-5p组AGS的细胞存活分数随照射剂量增加逐渐下降，差异有统计学意义（P<0.05），而且LHPP蛋白表达显著增多（P<0.05），CyclinD1表达下降（P<0.05），γ-H2AX表达增多（P<0.05），细胞存活率显著降低（P<0.05），放射增敏比SER为 1.641；与miR-766-5p+si-con组相比，miR-766-5p+si-LHPP组的细胞存活分数显著升高（P<0.05），LHPP表达显著减少（P<0.05），CyclinD1表达上升（P<0.05），γ-H2AX表达减少（P<0.05），细胞存活率显著上升（P<0.05），放射增敏比SER为0.604，见表4，5。说明敲减LHPP可逆转anti-miR-766-5p对AGS细胞增殖和放射敏感性的作用。

表4 敲减LHPP可以逆转anti-miR-766-5p对AGS细胞增殖和相关蛋白的影响/±s

表4 敲减LHPP可以逆转anti-miR-766-5p对AGS细胞增殖和相关蛋白的影响/±s

注：①与anti-miR-con组比较，P<0.05。②与anti-miR-766-5p+si-con组比较，P<0.05。

组别anti-miR-con anti-miR-766-5p anti-miR-766-5p+si-con anti-miR-766-5p+si-LHPP F值P值细胞存活率/%100.00±2.46 60.01±1.16①58.97±0.68 89.01±1.16②559.241 0.000重复次数3 3 3 3 LHPP 0.43±0.05 1.12±0.11①1.10±0.11 0.70±0.08②39.21 0.000 CyclinD1 1.10±0.12 0.41±0.05①0.42±0.05 0.89±0.11②45.52 0.000 γ-H2AX 0.83±0.09 1.38±0.14①1.34±0.13 1.05±0.11②14.21 0.000

表5 各组AGS细胞转染处理联合X射线照射对AGS胃癌细胞作用的单击多靶模型的参数值

3 讨论

胃癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，其5年生存率约为25%，在确诊时4%的病人已发生转移[6]。放射抵抗和耐受是癌症转移和复发的主要原因，严重威胁病人生存质量。γ-H2AX在多种癌症中表达异常，与辐射导致DNA双链断裂的修复有关，是放疗耐受的主要标志物之一[7]。

研究表明，miRNA在胃癌中表达异常，以抑癌或致癌的作用影响着胃癌的发生发展，在临床中具有诊断和预后标志物及化疗工具等作用[8]。miR-766-5p在结直肠癌组织中含量显著高于正常组织，抑制其表达可靶向癌细胞侵袭抑制因子（SCAI）抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡[4]。miR-766在肝细胞癌组织中表达上调并与病人预后有关，通过靶向NR3C2促进癌症进展[9]。Wang等[10]通过对多个肿瘤细胞系研究发现，miR-766通过直接靶向p53抑制因子MDM4来提高p53水平和信号活性，增强了p53介导的细胞周期阻滞和增殖抑制。miR-766-5p在胃癌中的表达和作用尚不清楚。本研究发现，miR-766-5p在胃癌细胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中表达量均显著上升，提示抑制miR-766-5p表达可抑制胃癌AGS细胞增殖并增强细胞的放射敏感性。另外，本研究通过发现，LHPP与miR-766-5p存在互补结合位点，双荧光素酶报告实验检测显示miR-766-5p可能调控LHPP的表达。LHPP是无机焦磷酸酶，也是一种蛋白组氨酸磷酸酶和肿瘤抑制因子，在肝细胞癌病人中，LHPP的低表达与肿瘤的严重程度增加和总体生存率降低有关[11]。基因组研究表明，LHPP与多种疾病的发生有关，包括抑郁症[12]、三阴性乳腺癌[13]、急性淋巴细胞白血病（ALL）[14]。李德馨等[15]最新研究表明，LHPP在低分化胃腺癌中表达下调，且与腺癌的分化程度相关。体外和体内实验表明，iDPP/LHPP纳米复合物对黑色素瘤生长有明显抑制作用，且无明显不良反应[16]。LHPP在膀胱癌组织和细胞中被下调，促进癌细胞的增殖和生长，LHPP可通过失活AKT/p65信号通路抑制膀胱癌细胞增殖和生长[17]。本研究结果表明，LHPP在胃癌细胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中表达量均显著下调，与李德馨等结果一致。进一步的实验结果表明，敲减LHPP可逆转抑制miR-766-5p对AGS细胞增殖和放射敏感性的作用，证实了miR-766-5p和LHPP在胃癌细胞中存在调控关系。

本研究阐述了在胃癌AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901细胞系中，miR-766-5p表达上调，LHPP表达下调。在胃癌AGS细胞中，抑制miR-766-5p可靶向促进LHPP表达，进而增强胃癌AGS细胞的放射敏感性，抑制癌细胞增殖。miR-766-5p是胃癌潜在的放射增敏靶点。

研究还表明，LHPP在宫颈癌组织和细胞系中也低表达，其过度表达可通过抑制AKT的激活降低细胞增殖、迁移和侵袭[5]。在结直肠癌细胞中过表达LHPP通过PI3K/AKT通路抑制结直肠癌细胞增殖[18]。在结直肠癌中下调miR-766-5p可抑制癌症进展[9]。因此推测miR-766-5p可能通过PI3K/AKT通路靶向LHPP抑制胃癌并增强其放射敏感性。下一步将研究miR-766-5p和LHPP在胃癌病人样本中的表达，及对肿瘤转移、侵袭，进一步探讨miR-766-5p和LHPP对胃癌临床诊断和治疗中的作用。