微小RNA-20a、微小RNA-92a在乳腺癌诊断及预后评估中的应用

罗思佳，袁野，张建新，金炜东

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病率呈上升趋势，并且呈现年轻化现象，严重威胁女性生命健康。由于乳腺癌的早期症状不明显，容易出现漏诊或误诊，确诊时往往处于中晚期[1]，因此，对乳腺癌病人的早期诊断以及寻找新型的非侵入性分子标志物监测乳腺癌病情变化及判断预后意义深远。微小RNA（miRNA）是一类非编码小分子RNA，研究发现，其在多种肿瘤中具有类似癌基因或抑癌基因的作用，且在疾病过程中的不同时期血清样本获取简单[2]，因此，血清miRNA作为肿瘤无创诊断及预后分子标志物的研究是一个重要的研究方向。miR-20a和miR-92a均是miR-17-92基因簇中的重要成员。目前，研究者们已在胃癌、膀胱癌和宫颈癌等多种肿瘤病人血清中发现miR-20a和miR-92a表达异常，且其与肿瘤的分化程度、预后等密切相关[3-5]。但二者在乳腺癌中的表达情况至今尚鲜有报道，基于此，本研究通过检测乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表达水平，分析其表达与病人临床病理特征及预后关系，为乳腺癌的诊断、病情监测及预后判断提供一种新方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2013年5月中国人民解放军中部战区总医院首次确诊为乳腺癌并行手术治疗的89例病人为观察组，年龄（63.52±8.14）岁，范围为40～81岁。所有乳腺癌病人术前均未进行任何治疗，且符合乳腺癌手术标准，具有完整的临床病例和病理资料。按2009年国际抗癌联盟与美国癌症联合委员会合作制定的乳腺癌TNM分期第七版标准进行TNM分期，其中Ⅰ期24例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例；有淋巴结转移35例，无转移54例。术前均进行血常规、肝肾功能、双乳双腋彩超、双乳钼靶腹部彩超检查，排除自身免疫性疾病病人，心脏、肾等重要器官损伤者，合并其他恶性肿瘤以及远处转移者。以同时期80例健康女性体检者作为健康对照组，年龄（65.31±8.51）岁，范围为39～83岁。病人或近亲属自愿签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 实验方法

1.2.1 血清总RNA提取 采集乳腺癌病人术前及术后和健康体检者清晨空腹静脉血，置于抗凝管中，离心（4℃，3 500 r/min，10 min）。取上清液−20℃保存备用。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒（QIAGEN），严格按照试剂盒操作说明提取血清总RNA，DEPC处理过的超纯水溶解。分光光度计检测RNA溶液分别在260 nm和280 nm处的吸光值（A），计算RNA的浓度和纯度。A260/A280比值>1.8时可用于检测miR-20a和miR-92a。

1.2.2 逆转录 利用逆转录试剂盒miScript Ⅱ RT Kit（QIA-GEN）将血清总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系共20 μL，包括1.5 μL逆转录缓冲液（10×），0.15 μL dNTP（10 mmoL/L），1 μL逆转录酶，0.19 μL RNase抑制剂，3 μL 逆转录引物，5 μL 总RNA，加水补足至20 μL。反应条件：37 ℃，1 h，使活化试剂中的逆转录酶充分活化；95℃，5 min，抑制逆转酶作用。反应结束后，将反应体系置于冰上防止10 min，然后加入200 μL无酶水，充分混匀。分装后−20℃保存备用。

1.2.3 定量PCR 利用实时定量PCR法检测miR-20a和miR-92a表达。内参U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTG-3'；miR-20a正向 5'-UAAAGU-GCUUAUAGUGCAGGUAG-3'，反向引物 5'-GCTAAAGTGCTTATAGTGCAGGT-3'；miR-92a正向引物 5'-GTCTCGTACCGTGAGTAAT-3'反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系：miRcute miRNA premix（2×）10 μL，Forward primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverseprimer（10 μmol/L）0.4 μL，miRNA 第一链cDNA 2 μL，ddH2O至20 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，总计 45 个循环。采用 2−ΔΔCt法，以 U6 为内参计算 miR-20a和miR-92a相对表达水平。

1.3 随访对所有乳腺癌病人进行复查或者电话随访，随访时间为5年，末次随访时间截止至2018年5月，病人生存状态为复发、死亡、存活；复发主要为局部复发、对侧新发和远处转移。记录病人局部复发时间、首次转移时间及死亡时间。

1.4 统计学方法采用统计学软件SPSS 21.0对数据进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料用例表示，采用χ2检验。Spearman相关性分析血清miR-20a和miR-92a表达相关性，ROC曲线分析miR-20a、miR-92a以及二者联合检测对乳腺癌的诊断价值，Kaplan-Meier法分析miR-20a和miR-92a表达对病人5年总生存期（overall survival，OS）影响，logistic回归分析影响乳腺癌预后的因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-20a和miR-92a表达水平比较与健康对照组比，乳腺癌病人术前血清miR-20a和miR-92a表达水平均显著升高（P<0.05）。与术前相比，乳腺癌病人术后血清miR-20a和miR-92a表达水平均显著下降（P<0.05）。见表1。

表1 乳腺癌病人术前及术后和健康对照组血清miR-20a和miR-92a表达水平比较/±s

表1 乳腺癌病人术前及术后和健康对照组血清miR-20a和miR-92a表达水平比较/±s

组别健康对照组观察组术前术后F值P值例数80 89 miR-20a 1.02±0.08 miR-92a 1.11±0.07 1.76±0.15 1.38±0.12 785.56 0.000 1.83±0.13 1.45±0.11 951.33 0.000

2.2 miR-20a和miR-92a表达与乳腺癌病人临床病理特征关系分别依据乳腺癌病人术前miR-20a和miR-92a表达水平的平均值将其分为高表达病人和低表达病人。miR-20a和miR-92a表达与乳腺癌病人年龄和肿瘤直径无关（P>0.05），与病人肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关（P<0.05）。见表2。

表2 miR-20a和miR-92a表达与临床病理特征关系

2.3 乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表达相关性Spearman相关性分析结果显示，乳腺癌病人血清miR-20a和 miR-92a表达呈线性正相关（r=0.52，P<0.05）。

2.4 miR-20a和miR-92a水平对乳腺癌病人诊断价值ROC曲线分析结果显示，miR-20a、miR-92a以及两者联合诊断乳腺癌的敏感度分别为77.0%、83.1%、92.1%特异度分别为78.7%、81.2%、90.0%，ROC曲线下面积（AUC）分别为0.807、0.808、0.946。与miR-20a、miR-92a单独诊断相比，两盒联合诊断时敏感度、特异度以及AUC均显著升高（P<0.05）。

2.5 生存曲线采用Kaplan-Meier法分析乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a与病人OS的影响。miR-20a和 miR-92a低表达病人OS分别为93.24%、94.85%，miR-20a和miR-92a高表达病人OS分别为73.28%、74.57%。miR-20a和 miR-92a低表达病人OS均显著高于高表达病人（P=0.011、0.007）。

2.6 logistic回归分析影响乳腺癌预后的因素以病人预后为因变量（复发、存活=1，死亡=0），以miR-20a、miR-92a、年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期、淋巴结转移为自变量进行Logistic回归分析，其中miR-20a、miR-92a为实测值，年龄：≥60岁=0，<60岁=1，肿瘤直径：<3 cm=0，≥3 cm=1，分化程度：高分化=0，中分化=1，低分化=2，TNM 分期：Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ 期=2，淋巴结转移：是=0，否=1。Logistic回归分析结果显示，miR-20a和miR-92a、分化程度、淋巴结转移均是影响乳腺癌病人预后的独立危险因素（P<0.05）。见表3。

表3 Logistic回归分析影响乳腺癌预后的因素

3 讨论

早发现、早诊断及早治疗可改善乳腺癌病人预后，降低死亡率。血清肿瘤标志物的检测对病人无创伤，具有较好的重复性，并且可在同一时间点对多项指标进行检测[6]，是肿瘤诊断和随访的理想手段。但是，多种肿瘤尤其是实体肿瘤标志物存在敏感度和特异度较低等缺点。因此，寻找合适的肿瘤标志物一直是肿瘤研究领域的热点之一。miRNA是一类非编码小分子RNA，长度为21-25个核苷酸，在细胞增殖、分化和凋亡以及个体发育等生命活动中发挥重要作用[7]。miRNA表达广泛，除了在肿瘤组织中异常表达外，在肿瘤病人血清中也表达异常。研究发现，miRNA与肿瘤的发生、转移、耐药等病理过程关系密切，除此之外，miRNA的稳定性非常高，在高温、过酸、过碱等环境中仍能维持稳定[8]。因此，血清miRNA是理想的肿瘤标志物。

miR-20a是miR-17-92基因簇中的重要成员，位于13号染色体。miR-20a在多种肿瘤中表达异常，且能够参与多种肿瘤的发生发展，另外通过调控肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等过程而发挥促癌或抑癌的作用[9]。Yang等[10]研究发现，血清 miR-20a水平与胃癌病人年龄、肿瘤分期、分化程度以及淋巴结转移相关，其高表达的胃癌病人存活率较低，血清miR-20a可作为胃癌诊断、疗效评估和预后的分子标志物。Chen等[11]研究发现，宫颈癌病人血清miR-20a的表达水平显著升高，淋巴结转移病人miR-20a水平显著高于未转移病人，ROC曲线分析显示miR-20a具有较高的敏感性和特异性，可能是检测宫颈癌病人淋巴结状态的潜在生物标志物。本研究结果显示，乳腺癌病人血清miR-20a水平较健康体检者显著升高，miR-20a高表达与肿瘤分化程度，淋巴结转移等密切相关，提示miR-20a参与乳腺癌的发生、发展过程。ROC曲线分析结果显示，miR-20a诊断乳腺癌的敏感度为77.0%，特异度为78.7%、AUC为0.807，说明miR-20a对乳腺癌的诊断具有一定价值。miR-20a高表达病人的OS显著低于低表达病人，是影响乳腺癌病人预后的独立危险因素，提示miR-20a高表达与病人预后不良相关，可作为乳腺癌预后不良的生物标志物。

血清指标的联合检测可提高疾病的诊断率和预后判断。洪宏等[12]研究发现血清miR-765和CA153联合检测对乳腺癌的诊断效能高于单一指标检测。张文昭等[13]研究发现，早期乳腺癌病人血清中miR-21、miR-195和miR-222表达水平均升高，三种指标的联合检测显著提高乳腺癌诊断的AUC、灵敏度和特异度，对早期乳腺癌有较高的诊断价值，有助于早期乳腺癌的筛查和诊断。miR-92a也是miR-17-92基因簇中的重要成员，在多种肿瘤中表达异常，与miR-20a联合检测可能会提高肿瘤的诊断率。仇俊兰、奉林[14]研究发现，结直肠癌病人血清miR-92a水平较健康对照组显著升高，结直肠癌肝转移组血清miR-92a水平显著高于无转移组，用于结直肠癌诊断时的灵敏度和特异度分别为75.3%和88.3%，是结直肠癌病人的早期诊断的生物学标志物，其水平上调病人预后较差。Kong等[15]研究发现，宫颈癌病人血清miR-92a的表达显著高于健康志愿者，晚期宫颈癌病人血清miR-92a表达高于早期病人，ROC分析显示，miR-92a诊断宫颈癌的灵敏度和特异性分别为69.6%和80.4%，AUC为0.808，血清miR-92a水平可作为宫颈癌诊断的独立标志物。本研究结果显示，与健康体检者相比，乳腺癌病人血清miR-92a水平显著升高，miR-92a高表达与肿瘤低分化、淋巴结转移和高TNM分期关系密切，提示miR-92a在乳腺癌的发生、发展过程中发挥重要作用，其高表达可能促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。ROC曲线分析结果显示，miR-92a诊断乳腺癌的敏感度分别为83.1%、特异度为81.2%、AUC为0.808，具有较高的诊断价值。miR-92a是影响乳腺癌病人预后的独立危险因素，其高表达病人OS显著低于低表达病人，提示miR-92a高表达病人的预后较差，可作为乳腺癌预后不良的生物标志物。相关性分析结果显示，miR-20a和miR-92a表达呈正相关，两者联合检测诊断乳腺癌的AUC、敏感度和特异度均显著升高，提示miR-20a和miR-92a联合检测可提高乳腺癌病人的诊断效能。另外通过logistic回归分析显示，miR-20a和miR-92a、淋巴结转移以及肿瘤分化程度均是影响乳腺癌预后的危险因素，此结果进一步说明血清miR-20a和miR-92a表达水平不仅与乳腺癌发生发展有关，同时也是影响预后的危险因素。

综上，乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表达水平均显著升高，与病人TNM分期、淋巴结转移相关，联合检测两者血清水平有助于乳腺癌的诊断，可能成为乳腺癌病人预后的分子标志物。进一步深入研究miR-20a和miR-92a在乳腺癌中发挥作用的分子学机制，可能为乳腺癌分子治疗提供新靶点。