TOLL样受体9/激活蛋白-1信号通路在过敏性鼻炎中的作用

王骏，李世东，景阳，杨颖，朱旭丽，贠勇刚

过敏性鼻炎为耳鼻喉科常见临床疾病，随着生活环境的改变，发病率呈逐年增高的趋势[1]。且过敏性鼻炎与其他多种呼吸系统疾病的发生发展均密切相关，研究表明，患过敏性鼻炎的病人，发生哮喘的比率明显高于其他人群[2]。过敏性鼻炎的机制复杂，相关因素较多。大多研究认为，由炎症递质引发的免疫细胞合成的相关细胞因子白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）等均参与了过敏性鼻炎的发病机制中[3]。目前认为，过敏性鼻炎是由免疫球蛋白E（IgE）介导的I型变态反应。TOLL样受体（TLRs）家族在机体免疫反应中发挥重要作用，TLRs与相应的配体结合后，能够通过相应的信号通路，介导机体炎症和免疫反应的发生[4]。激活蛋白-1（AP-1）是支气管哮喘发病的关键因子，处于TLR9信号通路下游。得到证实，通过抑制TLR9/AP-1信号通路能够有效控制哮喘的发作[5]。本研究自2019年3—8月研究TLR9/AP-1信号通路在过敏性鼻炎中的作用机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组清洁级健康雄性SD大鼠48只，体质量200～300 g，购于陕西省人民医院实验动物中心，在安静、温暖（18～25℃）、避强光、昼夜光照节律的实验室饲养1周后供本研究实验所用，自由饮水和摄食。为每只SD大鼠编号，按照随机数字表法分为对照组、实验组、干预组，每组16只。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 实验组、干预组大鼠参考文献[6]中的方法进行过敏性鼻炎大鼠的动物模型制备：造模第1天，将卵清蛋白（OVA）0.3 mg、氢氧化铝30 mg溶于1 mL生理盐水中，腹腔注射。第15～21天，每日每侧鼻孔滴入4%的OVA 50 μL；1%OVA雾化吸入5 min。末次滴鼻致敏后，1、2、3、6 h观察大鼠鼻痒、喷嚏、清涕等行为，根据参考文献[6]中记分方法总分大于5分为造模成功。对照组操作步骤与实验组、干预组相同，腹腔注射、鼻滴、雾化吸入均使用生理盐水。

1.2.2 干预措施 干预组造模成功后给予0.05%丙酸氟替卡松0.1 mL滴鼻；实验组造模成功后给予生理盐水0.1 mL滴鼻；对照组给予生理盐水0.1 mL滴鼻，三组均每日1次，共7次。

1.2.3 标本采集 血液标本采集：将各组16只大鼠按照随机数字表法分为两组，每组8只，分别于末次干预后6、12 h采用腹主动脉抽血法处死。采集血液后抗凝，离心，采集血清。鼻黏膜组织采集：大鼠处死后，从鼻背正中缝处裂开鼻腔，剥离下鼻黏膜组织−70℃冻存。

1.2.4 观察指标及检测方法 应用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中TNF-α、IL-4、IgE含量（检测试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司）。参考文献[6]中方法对鼻痒、喷嚏、清涕进行评分，评分越高表明上述症状越严重。蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组大鼠鼻黏膜组织中CFos、C-Jun表达。

1.3 统计学方法实验数据应用SPSS 22.0软件分析，正态计量资料用±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析，多组之间两两比较采用SNK-Q检验的方法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠干预后血清IgE、IL-4、TNF-α水平比较统计结果显示，实验组、对照组大鼠干预后6、12 h的血清IgE、IL-4、TNF-α水平均差异无统计学意义（P>0.05）。干预组大鼠，干预后12 h的血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明显低于干预后6 h，差异有统计学意义（P<0.01）。干预后6、12 h，实验组大鼠血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明显高于对照组，干预组大鼠血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明显低于实验组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠干预后血清免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平比较/±s

表1 各组大鼠干预后血清免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平比较/±s

注：①与对照组比较，P<0.05。②与干预后6 h比较，P<0.05。③与实验组比较，P<0.05。

组别对照组实验组干预组F值P值干预后12 h 10.04±1.03 18.36±1.16①13.33±1.03①②③19.58<0.01例数8 8 8 TNF-α/（ng/L）干预后6 h 32.33±2.26 57.25±5.15①48.53±4.18①③23.01<0.01干预后12 h 33.12±3.12 57.21±5.21①42.37±3.97①②③18.25<0.01 IL-4/（ng/L）干预后6 h 56.55±6.08 75.33±7.16①65.12±5.47①③23.14<0.01干预后12 h 57.35±5.26 74.06±6.53 60.06±8.53②③22.06<0.01 IgE/（IU/mL）干预后6 h 11.39±1.56 18.65±1.09①15.95±1.02①③20.00<0.01

2.2 各组大鼠干预后鼻痒、喷嚏、清涕评分比较统计结果显示，实验组、对照组大鼠干预后6、12 h的鼻痒、喷嚏、清涕评分均差异无统计学意义（P>0.05）。干预组大鼠，干预后12 h的鼻痒、喷嚏、清涕评分均明显低于干预后6 h，差异有统计学意义（P<0.01）。干预后6、12 h，实验组大鼠鼻痒、喷嚏、清涕评分均明显高于对照组，干预组大鼠鼻痒、喷嚏、清涕评分均明显低于实验组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

表2 各组大鼠鼻痒、喷嚏、清涕评分比较/（分，±s）

表2 各组大鼠鼻痒、喷嚏、清涕评分比较/（分，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05。②与干预后6 h比较，P<0.05。③与实验组比较，P<0.05。

组别对照组实验组干预组F值P值干预后12 h 1.125±0.110 2.750±0.116①1.625±1.03①②③9.53<0.01例数8 8 8鼻痒干预后6 h 1.125±0.110 2.500±0.150①1.875±0.128①③13.03<0.01干预后12 h 1.125±0.110 2.250±0.212①1.375±3.97①②③12.21<0.01喷嚏干预后6 h 1.125±0.110 2.625±0.126①2.250±0.147①③13.17<0.01干预后12 h 1.125±0.110 2.750±0.132 1.875±0.153②③12.09<0.01清涕干预后6 h 1.125±0.110 2.875±0.119①2.125±0.102①③10.10<0.01

2.3 各组大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun表达水平比较实验组大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun灰度值明显高于对照组，干预组大鼠鼻黏膜组织中CFos、C-Jun明显低于实验组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。图1。

表3 蛋白质印迹法（Western Blotting）检测各组大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun灰度值/±s

表3 蛋白质印迹法（Western Blotting）检测各组大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun灰度值/±s

注：①与对照组比较，P<0.05。②与实验组比较，P<0.05。

组别对照组实验组干预组F值P值C-Fos 0.425±0.050 0.850±0.012①0.575±0.047①②10.29<0.01例数8 8 8 C-Jun 0.425±0.030 0.950±0.052①0.615±0.047①②11.57<0.01

图1 各组大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun表达

3 讨论

TLRs家族在机体免疫反应中发挥重要作用，能通过识别相关分子诱导体内免疫应答的发生。呼吸道鼻黏膜富含巨噬细胞、树突状细胞等，具有较高水平的TLRs表达[7]。TLRs与相应的配体结合后，能够通过相应的信号通路，介导机体炎症反应的发生，以及免疫细胞对外来抗原的杀伤作用。大量的研究结论均证实，TLR受到病原体的刺激后，能够通过激活多个信号传导通路诱导相关基因的表达，参与体内炎症反应、免疫反应的发生发展[8-10]。AP-1是调节细胞生存和死亡途径的关键转录因子，能通过调节细胞因子、生长因子等的分泌，参与细胞的增殖、炎症等过程[11]。徐甜等[12]在研究中对药物治疗过敏性鼻炎的靶点进行筛选，研究结果显示，药物抗过敏性鼻炎的作用机制可能与AP-1、肿瘤坏死因子-α等有关。AP-1处于TLR9信号通路下游，由C-Jun、C-Fos核蛋白构成。已经得到证实，AP-1是支气管哮喘发病的关键因子，AP-1的水平与哮喘病人的症状严重程度呈正相关关系[13]。通过抑制AP-1及其下游因子的释放和分泌（IgE、IL-4、TNF-α等），能有效控制哮喘的发作[14]。

过敏性鼻炎为I型变态反应，是一种Th2偏离性慢性炎症反应。Th2细胞可通过分泌IL-4、IL-5等细胞因子促进B淋巴细胞合成IgE，IgE通过与肥大细胞与嗜碱性粒细胞的结合，释放组胺、白三烯等多种炎性递质，引起喷嚏、流涕等症状的发生[15]。TNF-α是具有多种生物学活性细胞因子，在机体免疫调节中发挥重要作用[16]。本研究中，通过检测各组大鼠血中IgE、IL-4、TNF-α的含量，反映体内炎性递质的水平。本研究统计结果显示，实验组、干预组干预后的IgE、IL-4、TNF-α水平均明显高于对照组，说明上述因子参与了过敏性鼻炎的发生。进一步统计发现，干预组IgE、IL-4、TNF-α水平、症状评分均明显低于实验组，说明经过药物的干预，能够对体内炎症水平和免疫反应发挥一定的抑制作用，能够明显改善过敏性鼻炎的症状。

为了进一步分析TLR9/AP-1信号通路在过敏性鼻炎中的作用，经Western blotting实验检测了各组大鼠干预后鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun的表达情况。结果证实，C-Fos、C-Jun 的表达情况与 IgE、IL-4、TNF-α的变化基本同步，说明TLR9/AP-1信号通路参与了过敏性鼻炎的发病过程，药物治疗可通过作用于该信号通路发挥有效的治疗效果。可见，药物治疗过敏性鼻炎的机制与抑制TLR9/AP-1信号通路及其下游因子的释放和分泌有关。