氟伐他汀调控Sirt3对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞增殖凋亡的影响

张承中，尹占海，李存宽，王成龙

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的多能干细胞，具有强大分化潜能[1]，已用于多种疾病的治疗。如BMSCs可分化为神经细胞，用于治疗阿尔茨海默病[2]；BMSCs还用于相关骨疾病的治疗[3]。寻找有效促进骨髓间充质干细胞增殖，抑制细胞凋亡的方法对治疗相关疾病具有重要意义。氟伐他汀是临床上常用的降血脂类药物，氟伐他汀可改善骨质疏松大鼠骨组织的骨生物力学性能和形态学结构[4]。有研究发现氟伐他汀可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖，迁移和细胞外基质积累[5]。氟伐他汀可抑制T淋巴细胞白血病细胞增殖、促进细胞凋亡[6]。Sirtuin-3（Sirt3）是sirtuin蛋白脱乙酰酶家族的重要成员之一，沉默Sirt3通过干扰脂肪来源的人间充质干细胞的线粒体功能而导致成脂分化和胰岛素抵抗受损[7]。有研究发现Sirt3可以减少过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡[8]。本实验自2019年1―8月研究氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞增殖凋亡的影响，探寻其机制是否与Sirt3有关。

1 材料与方法

1.1 材料胎牛血清、DMEM培养液、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司；氟伐他汀购自北京诺华制药有限公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自北京碧云天生物公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒购自日本同仁研究所。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分离培养 取2只清洁级4周龄SD大鼠（购自上海凯学生物科技有限公司），将SD大鼠麻醉处死，用75%乙醇浸泡15 min后在超净工作台中取大鼠双侧股骨，PBS反复冲洗干净，用含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素双抗的DMEM培养液冲洗骨髓腔，将冲洗出的髓状物接种于培养瓶中，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，3 d换液一次，显微镜下观察细胞生长情况，当融合度在80%左右时进行消化传代，取3代后细胞用于实验。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.2.2 细胞处理和分组 实验分为正常组、模型组、三个干预组、干预组2+si-NC、干预组2+si-Sirt3；将BMSCs用400 μmol/L的过氧化氢培养6 h作为模型组；将BMSCs用400 μmol/L的过氧化氢培养的同时分别加入0.01、0.1、1 μmol/L氟伐他汀作为三个干预组；未添加任何物质正常培养的细胞作为正常组；将si-NC、si-Sirt3转染至BMSCs中再用400 μmol/L的过氧化氢、0.1 μmol/L氟伐他汀处理作为干预组2+si-NC组、干预组2+si-Sirt3组。

1.2.3 蛋白质印迹（Western Blotting）法检测蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，经电泳将蛋白转至PVDF上，封闭1 h后分别加入Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、Sirt3一抗（1∶1 000），4 ℃过夜；再加入二抗（1∶2 000），室温孵育2 h；显影，定影，分析蛋白条带灰度值。

1.2.4 MTT检测细胞存活率 各组细胞培养48 h时，加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μL的DMSO，振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm吸光度（OD）值。细胞存活率（%）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，按照试剂盒说明书，分别加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，孵育后上流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法实验数据使用SPSS 22.0进行统计分析。观测资料主要为计量数据，以±s表示。两组间数据比较采用两独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析+多重比较HSD-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs细胞增殖的影响与正常组相比，模型组细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达水平、细胞存活率显著降低，P21表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，氟伐他汀三个干预组Cyclin D1表达水平、细胞存活率显著升高，P21表达水平显著降低（P<0.05）。见图1，表1。

图1 增殖相关蛋白的表达

表1 氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响/±s

表1 氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响/±s

注：Cyclin D1为细胞周期蛋白D1，P21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A。①与正常组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

重复次数9 9 9 9 9 Cyclin D1 0.78±0.08 0.14±0.01①0.25±0.02②0.48±0.05②0.46±0.04②241.78 0.000组别正常组模型组干预组1干预组2干预组3 F值P值P21 0.22±0.02 0.84±0.08①0.60±0.06②0.43±0.04②0.40±0.03②191.74 0.000存活率/%100.40±10.23 41.57±4.32①50.03±5.08②79.72±8.00②76.42±7.48②96.84 0.000

2.2 氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs细胞凋亡的影响与正常组相比，模型组Bax表达水平、细胞凋亡率显著升高，Bcl-2表达水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，氟伐他汀三个干预组Bax达水平、细胞凋亡率显著降低，Bcl-2表达水平显著升高（P<0.05）。见图2，表2。

图2 氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表达的影响

表2 氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响/±s

表2 氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响/±s

注：①与正常组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

分组正常组模型组干预组1干预组2干预组3 F值P值凋亡率/%8.28±0.92 38.57±4.04①32.05±3.25②16.17±1.83②17.06±1.75②211.22 0.000重复次数9 9 9 9 9 Bax 0.17±0.02 0.79±0.08①0.62±0.06②0.35±0.04②0.33±0.03②229.03 0.000 Bcl-2 0.91±0.09 0.23±0.02①0.36±0.03②0.59±0.06②0.60±0.06②175.18 0.000

2.3 氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs细胞中Sirt3表达的影响与正常组相比，模型组Sirt3表达水平显著降低[（0.31±0.03）比（1.01±0.10），P<0.05]；与模型组相比，氟伐他汀干预组2中Sirt3表达水平显著升高[（0.68±0.07）比（0.31±0.03），P<0.05]。见图3。

图3 Sirt3蛋白的表达

2.4 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs细胞增殖的作用与干预组2+si-NC组相比，干预组2+si-Sirt3组中Sirt3、Cyclin D1表达水平、细胞存活率显著降低，P21表达水平显著升高（P<0.05）。见图4，表3。

图4 Sirt3和增殖相关蛋白的表达

表3 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响/±s

表3 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响/±s

组别干预组2+si-NC干预组2+si-Sirt3 t值P值重复次数9 9 Sirt3 0.70±0.07 0.36±0.04 12.652 0.000 Cyclin D1 0.50±0.05 0.25±0.02 13.927 0.000 P21 0.40±0.04 0.72±0.07 11.907 0.000存活率/%80.19±8.07 47.29±4.82 10.498 0.000

2.5 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs细胞凋亡的作用与干预组2+si-NC组相比，干预组2+si-Sirt3组中Bax表达水平、细胞凋亡率显著升高，Bcl-2表达水平显著降低（P<0.05）。见图5，表4。

图5 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表达的影响：A为细胞凋亡图；B为凋亡相关蛋白的表达

表4 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响/±s

表4 抑制Sirt3能逆转氟伐他汀对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响/±s

注：Bax为Bcl相关X，Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2。

组别凋亡率/%重复次数Bax Bcl-2干预组2+si-NC9 0.33±0.030.57±0.0615.96±2.00干预组2+si-Sirt390.70±0.070.28±0.0333.17±3.46 t值14.5812.9712.92 P值0.0000.0000.000

3 讨论

BMSCs能分化为成骨细胞、软骨细胞和成纤维细胞等，其因体外扩增繁殖能力强而被广泛用于治疗骨质疏松、骨关节炎等骨损伤[9]。研究发现氧化应激可影响BMSCs的活性，因此提高BMSCs的抗氧化应激能力有利于其移植治疗成功[10]。本实验用过氧化氢处理BMSCs，结果显示细胞存活率降低，细胞凋亡率升高。表明过氧化氢可以抑制BMSCs增殖，诱导BMSCs凋亡。有研究发现辛伐他汀可促进大鼠髓核间充质干细胞增殖和细胞外基质的分泌[11]。氟伐他汀可以增加类风湿性关节炎患者的骨保护素水平并改善疾病活动性变量[12]。氟伐他汀还能减少活性氧的产生，减少脂多糖诱导的体内破骨细胞生成和骨侵蚀[13]。说明氟伐他汀具有抗氧化能力和保护骨损伤的功能。本实验用不同浓度的氟伐他汀处理过氧化氢作用的BMSCs，结果显示，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，表明不同浓度的氟伐他汀均可促进BMSCs增殖，抑制过氧化氢作用的BMSCs凋亡。提示氟伐他汀具有保护BMSCs使其免受损伤的作用。

Sirt3具有抗氧化作用[14]，有研究发现老年人间充质基质/干细胞中Sirt3的减少增加了细胞对氧化应激的敏感性[15]。过表达Sirt3可降低氧化应激水平并增强间充质干细胞的寿命和分化能力[16]。Sirt3转染骨髓间充质干细胞促进了细胞的增殖和分化[17-18]。表明Sirt3促进间充质干细胞增殖分化的作用。本实验结果显示，过氧化氢作用的BMSCs中Sirt3表达水平降低，氟伐他汀处理后Sirt3表达水平升高，抑制Sirt3表达逆转了氟伐他汀对过氧化氢诱导的BMSCs增殖抑制和凋亡促进作用。提示，氟伐他汀可能通过调控Sirt3影响过氧化氢诱导的BMSCs的增殖和凋亡。

综上所述，氟伐他汀能抑制过氧化氢诱导的BMSCs细胞凋亡，促进细胞增殖，其机制可能与上调Sirt3有关。将可为减轻BMSCs氧化应激，提高其移植治疗成功率提供理论参考和依据。