用反相HPLC法检测人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK含量的效果研究

浦 滇，李 俊⋆，李 芮，包崇卯，艾 黎，黄娜娜，和秋婷，刘雨珊，王生凡，范常伟

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省高校药食同用资源养生产品工程研究中心，云南 昆明 650500；3.云南与诺生物工程有限责任公司，云南 昆明 650217）

人参皂苷CK（compound K）为原人参二醇类人参皂苷。人参皂苷CK是人参皂苷在人体内吸收和发挥药理作用的主要形式之一，具有较高的生物活性[1]。但其在人参属植物中的含量较低，无法满足开发应用的需求。目前人参皂苷CK主要是通过微生物转化和酶转化制备得到[2]。有学者发现了人参皂苷经过肠道细菌转化成人参皂苷CK的代谢过程，这为人参皂苷CK后续的研究奠定了基础[3]。之后的研究发现，人参皂苷CK具有保护心肌、抗炎、抗皮肤衰老、改善血糖、保护肝脏、抗过敏、保护神经、抗肿瘤等多种药理活性[3]。软胶囊是将液体原料药物或由固体原料药物溶解、分散制成的溶液、混悬液、乳状液或半固体颗粒密封于软质囊材中的胶囊剂，具有有效成分含量高、吸收迅速、稳定性好、能掩盖药物的不良气味、外形美观等特点[4]。通过使用不同的囊壳材料，可制成肠溶胶囊、咀嚼胶囊、缓释胶囊等不同特性的软胶囊。软胶囊中可以装载各种类型的内容物，如混悬液、溶液、半固体颗粒、固体颗粒、自微乳化释药系统等[5]。本研究主要是探讨采用反相高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK含量的效果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号：Agilent 1260）；高效液相色谱仪（型号：SHIMADZU LC-2030）；中谱蓝XY-C18Ⅱ色谱柱（规格为4.6 mm×250 mm、5 μm）；十万分之一电子天平（型号：AB265-S）；万分之一电子天平（型号：BSM120.4）；百分之一电子天平（型号：XCC-2002）；超声波清洗器（型号：SK3300H）。

1.2 材料

甲醇（分析纯，批号为190815，由四川西陇科学有限公司生产）；纯化水（自制）；超纯水；甲醇（色谱纯，批号为I1082407013，由默克股份两合公司生产）；乙腈（色谱纯，批号为JB098030，由默克股份两合公司生产）；人参皂苷CK对照品（质量分数≥98.67，批号为RFS-R02811809026，由信阳市中检计量生物科技有限公司生产）；人参皂苷CK软胶囊（批号为20210101、20210301、20210302、20210303，自制）和空白软胶囊（自制）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷CK对照品10.13 mg，加入甲醇溶解并定容至10 mL，制得浓度为1.013 mg/mL的对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，加入甲醇定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，得到浓度为0.2026 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取装量差异下的人参皂苷CK软胶囊内容物0.1000 g，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇适量定容至10 mL。对溶液进行10 min的超声处理后放冷并摇匀，取上清液过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得到供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为中谱蓝XY-C18Ⅱ色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水溶液为流动相B，按表1中的数据进行梯度洗脱。体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为203 nm，柱温为30 ℃。理论塔板数按人参皂苷CK峰计算应不低于6000。

表1 反相HPLC法中的梯度洗脱数据

2.4 专属性实验

分别精密吸取人参皂苷CK对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，按上述色谱条件进行检测。检测的结果显示，人参皂苷CK的色谱峰与相邻色谱峰的分离度良好，对称因子在0.95～1.05之间，理论板数大于6000。对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间均有出峰，阴性对照品溶液对人参皂苷CK的检测无干扰。说明该检测方法的专属性强。检测结果见图1-3。

图1 人参皂苷CK对照品溶液的反相HPLC图

图2 供试品溶液的反相HPLC图

图3 阴性对照品溶液的反相HPLC图

2.5 线性关系考察

分别配制浓度为1.013 mg/mL、0.5065 mg/mL、0.2026 mg/mL、0.1013 mg/mL、50.65 μg/mL、10.13 μg/mL的人参皂苷CK对照品溶液，各精密吸取10 μL，按上述色谱条件进行检测。以峰面积（Y）为纵坐标，人参皂苷CK对照品的质量浓度（X）为横坐标，得到人参皂苷CK的线性回归方程为：y=4081.4x+3.2324，R2=1。该结果表明，在采用反相HPLC法进行检测时，人参皂苷CK在10.13～1.013 mg/mL的范围内线性关系良好。

2.6 稳定性实验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12h、24 h注入液相色谱柱中，按上述色谱条件进行检测，记录峰面积。检测的结果显示，对照品溶液峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.10%，供试品溶液峰面积的RSD为1.13%。该结果表明，对照品溶液和供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.7 加样回收试验

精密称取人参皂苷CK软胶囊内容物适量，加入人参皂苷CK对照品溶液适量，配制成浓度分别为80%、100%和120%的供试品溶液。将各浓度的供试品溶液均制备3份，按上述色谱条件进行检测，以外标法计算其中人参皂苷CK的含量，并计算其加样回收率。结果显示，80%、100%、120%供试品溶液的平均加样回收率分别为99.07%、101.01%、100.92%，RSD分别为1.89%、0.92%、1.82%。详见表2。

表2 人参皂苷CK软胶囊内容物加样回收率试验结果

2.8 人参皂苷CK含量的测定

精密称取0.1000 g的人参皂苷CK软胶囊内容物，加入甲醇稀释并定容至10 mL。对溶液进行10 min的超声处理，过0.22 μm的滤膜，取续滤液。按上述色谱条件测定人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK的含量。检测的结果显示，每粒人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK的含量为10 mg。

3 讨论

人参皂苷CK的极性较低，故本研究选用反相HPLC法对人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK的含量进行检测。人参皂苷CK属于四环三萜达玛烷型人参皂苷，在203 nm处有最大吸收波长，故本研究进行检测时选用203 nm作为检测波长。本研究依据2020版《中国药典》[6]中的相关规定采用HPLC法检测人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK的含量，检测结果符合《中国药典》中关于人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK含量的规定。

本研究的结果证实，采用反相HPLC法检测人参皂苷CK软胶囊中人参皂苷CK含量的效果显著，具有简单易行、专属性强、重复性好、稳定性和精密度高等优点。