氨氮质量浓度及附着基筛选对硝化细菌氨氮净化影响

2022-01-26穆显鑫苗德霞孙丹妮张文平陈会娟

水产科学 2022年1期

穆显鑫，苗德霞，孙丹妮，张文平，闫密，陈会娟，朱明

( 江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏连云港 222005 )

随着工业化进程的不断推进，随之而来的是水资源污染的日益严重。氨氮污染是水资源污染的主要原因之一，能够引起水体的富营养化，导致水体蓝藻、绿藻暴发，水质变臭变黑等[1]。目前处理水体氮元素污染的常用方法是利用生物菌剂来实现硝化脱氮[2-3]。水体中硝化细菌与反硝化物均能够将含氮化合物转化为氮气。其中硝化细菌是通过亚硝化作用将水中的氨氮转化为亚硝酸盐与硝酸盐，后在无氧缺氧的条件下通过反硝化作用，将亚硝酸盐与硝酸盐转变为氮气排出[4]。目前常用的净化方法有制备硝化细菌优势菌群活性污泥及包埋法固定化硝化细菌[5]。利用聚乙烯醇(PVA)作为骨架载体[6]，再添加适当添加剂，使其与活性炭结合。汪怀建等[7]以聚乙烯和海藻酸钠作为复合骨架，并且以氯化钙和一定含量的硼酸溶液混合作为交联剂，将芽孢杆菌(Bacillussp.)固定在凝胶球上形成固定化颗粒。

微生物固定化技术为高效脱氮提供了理论、技术与新思维方式。目前已经有一些成型的工艺与生物过滤器出现，例如缺氧—好氧(A/O)[8]、厌氧—缺氧—好氧(A/A/O)[9]、间歇式活性污泥法(SBR)、曝气生物滤池(BAF)等[10]。这些传统工艺中硝化与反硝化不能同时进行，分开反应需要投入更多的空间和成本。目前微生物固定化的成本依然很高，优良的固定化材料是一个相当重要的研究内容，笔者主要研究现在几种常用的固定材料的固定效果，通过比较菌种附着数量、氨氮处理效率来论证硝化细菌的最优附着材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

本试验选用硝化细菌——食油假单胞菌(Pseu-domonasoleovorans)X14-1-1为试验菌种[11](江苏海洋大学海洋科学水产学院N310实验室提供)。

1.1.2 生物填料

陶粒、聚氯乙烯、流化床、无纺布、纤维丝、火山岩[12]。

1.1.3 人工海水

沸水冷却后加入3%的海水晶(浙江蓝海星盐制品有限公司)人工配制；pH 7.8，盐度30。

1.1.4 氨氮配制

氨氮质量浓度通过硫酸铵配制(0.024 g/L，氨氮质量浓度为5 mg/L递增)；另加入氯化钠、氯化镁、硫酸亚铁等无机营养盐满足细菌生长。

1.2 试验方法

1.2.1 附着基的预处理

附着基需要对其面积进行控制，将各组附着基的面积尽量控制一样。聚氯乙烯附着基可以剪成立方体，计算其表面积；无纺布可以剪成扁平状立方体，计算其表面积；陶粒为球形，计算其表面积；纤维材质难以计算其表面积，将其捆在聚氯乙烯材质的附着基上，覆盖其表面；流化床由厂家提供表面积。

1.2.2 氨氮、硝态氮与亚硝酸盐的测定

氨氮用纳氏试剂分光光度法测定；亚硝态氮的测定用盐酸α-萘胺比色法；硝态氮的测定用紫外分光度法[13-15]。

降解率(R，%)按下式计算：

R=(ρ0-ρ1)/ρ0

式中，ρ0为初始质量浓度(mg/L)，ρ1为最终质量浓度(mg/L).

1.2.3 菌种制备

接种食油假单胞菌X14-1-1：本试验共设置3个试验组，2个空白对照组。

扩培：用接种环挑取菌株接入液体培养基中，2个试验组与1个空白对照组。

接入试验组：将扩培组中的菌液在180 r/min的摇床上摇3 min混匀，用移液枪吸取100 μL，接入试验组。每组3个平行，1组为未加附着基的空白对照组。

1.2.4 不同初始质量浓度氨氮降解试验

将带有试验用菌的附着基放入1 L充气瓶内共培养。分别设置氨氮初始质量浓度为0(不加硫酸铵)、10、20、30、40、50、60 mg/L共7个梯度，除质量浓度为0组外，其余每组设定3个平行。放入光照培养箱(杭州钱江仪器设备有限公司)，培养温度为20 ℃；光照度为5000 lx(光照周期12L∶12D)，设定充氧1 L/h。分别于第0、1、2、3、4天于充气瓶内随机抽取10 mL水样置采样瓶中，测定氨氮(NH4+-N)质量浓度。

1.2.5 梯度增加氨氮方法

采用相同初始氨氮质量浓度，投加经硝化细菌附着的附着基，温度20 ℃下进行培养。加入氨氮情况见表1。

表1 梯度增加氨氮情况 mg/LTab.1 Gradient increase of ammonia nitrogen

1.3 分析方法

1.3.1 硝化细菌的计数

计数环节分为剩余菌液密度计算与附着基附着密度计算。

硝化细菌的计数采用平板计数法。

1.3.2 数据处理

通过软件Origin 9进行数据分析处理，用单因素方差分析比较各组附着基附着菌种数量、菌液密度。

2 结果与分析

2.1 附着基上细菌的附着效果

将硝化细菌附着基捞出后，放入经高温灭菌的生理盐水中，于180 r/min的摇床上振荡5 min，使菌种被摇下后再用移液枪吸取生理盐水洗刷附着基，最后拿出附着基，对200 mL生理盐水中的菌种进行梯度稀释，平板计数。发现104、105、106cfu/mL这3个梯度的平板合适(表2)，每组设3个平行。

表2 附着基菌液密度 1×105 cfu/mLTab.2 Density of P. oleovorans X14-1-1 on the attachments

通过单因素方差分析发现，聚氯乙烯、无纺布与纤维附着基菌液密度显著高于其他组(P<0.05)，且两组间差异不显著；陶粒与火山岩附着基菌液密度适中差异不显著(P>0.05)；流化床菌液密度显著低于其他组(P<0.05)。其中纤维附着基菌液密度是陶粒的2.15倍，是流化床密度的3.48倍。聚氯乙烯材质的菌液密度是陶粒的1.93倍，是流化床的3.12倍。因此聚氯乙烯、无纺布与纤维作为附着基效果最好。

2.2 氨氮、亚硝态氮与硝态氮的测定

2.2.1 氨氮的测定

标准曲线为y=7.88571x+0.01086(x为测得吸光度，y为氨氮质量浓度)。

测量氨氮质量浓度后发现，在曝气条件下空白组的氨氮去除率也能达到50%。聚氯乙烯、无纺布与纤维的去除效率较高，在2 d的时间氨氮去除逾90%[16]；陶粒与火山岩的去除效率适中；流化床去除效率比较低，与空白组差异不显著(P>0.05)。

硝化速率测定[17]：聚氯乙烯组的硝化速率最高达到了0.89 mg/h；无纺布与纤维的硝化速率也较高；陶粒与火山岩硝化速率适中；流化床组硝化速率显著低于其他组(表3)。

表3 氨氮去除率及最大硝化速率Tab.3 Ammonia nitrogen removal rate and maximum nitrification rate

氨氮趋势：由图1可见，纤维因前期培养过程中附着了大量的硝化细菌，所以纤维组前期的处理效率显著高于其他组，氨氮下降速率较快。其余5组试验组在1.0～1.5 d这段时间里净化氨氮速率情况均有明显提高，说明硝化细菌于附着基开始繁殖，当繁殖数量达到一定后硝化速率开始有明显上升。而在后期各组间硝化效率均有下降，可能原因为此时氮源不够充足。总体来看，氨氮去除率聚氯乙烯、无纺布、纤维及陶粒净化氨氮效果相对较好。

图1 水体氨氮质量浓度随时间变化Fig.1 Changes in ammonia nitrogen concentration in water with time

2.2.2 亚硝态氮与硝态氮的测定

亚硝态氮标准曲线为y=0.06751x-0.0045(x表示测得吸光度，y表示亚硝态氮质量浓度)。

在30 ℃水浴、溶解氧2.5 mg/L的条件下培养，测量于0、0.5、1.0、1.5、2.0 d亚硝态氮的质量浓度，测量发现，在前期0～0.5 d，亚硝态氮的质量浓度处于上升状态，但由于曝气效率高，所以亚硝态氮均未有过多累积，迅速转化为硝态氮(表4)。

表4 亚硝态氮质量浓度 mg/LTab.4 Nitrite concentration

硝态氮的标准曲线方程y=0.07044x-0.00387(x表示测得吸光度，y表示硝态氮质量浓度)。

在30 ℃水浴、溶解氧2.5 mg/L的条件下，培养测量其0、0.5、1.0、1.5、2.0 d的硝态氮质量浓度，测量发现在前期0～0.5 d亚硝态氮的质量浓度处于上升状态，但是由于曝气效率高，所以亚硝态氮未过多累积，迅速转化为硝态氮，硝态氮含量在0.5 d之后讯速上升(表5)。

表5 硝态氮质量浓度 mg/LTab.5 Nitrate nitrogen concentration

2.2.3 氨氮、硝态氮、亚硝态氮的动态变化

将聚氯乙烯、无纺布与纤维3组数据中氨氮、亚硝态氮与硝态氮作动态分析，观察三者的变化情况。在0～0.5 d内，3组亚硝态氮与硝态氮均有轻微上升，氨氮也有下降；在0.5～1.0 d内，在溶解氧较高的情况下亚硝态氮难以大量累积[18]，迅速转化为硝态氮。随后亚硝态氮上升且速率较快，但无亚硝态氮的累积，应该是硝化过程中效率最高的时间。综合情况来看，聚氯乙烯硝态氮及亚硝态氮结果均优于无纺布和纤维，且氨氮净化速率与另外2组差异不显著(P>0.05)(图2～4)。

图2 聚氯乙烯转化效率Fig.2 The conversion efficiency of polyvinyl chloride

2.2.4 pH对硝化细菌影响比较

为探究氮源净化后水体pH发生变化是否会影响氨氮净化速率，设置如下试验：采用相同初始质量浓度氨氮，投加经硝化细菌附着的附着基，温度20 ℃下，pH通过CaO进行控制，设定pH分别为7、6、5进行培养(表6)，探究pH变化后对硝化细菌氨氮净化速率影响。试验结果表明，pH偏酸性情况下，氨氮质量浓度未发生明显变化(P>0.05)。可能因该菌株从海水底泥中提取，对盐度及酸性有一定抵御能力。因此本试验过程中均不再考虑水体pH对硝化细菌净化速率的影响。

图3 无纺布转化效率Fig.3 The conversion efficiency of non-woven fabric

图4 纤维转化效率Fig.4 The conversion efficiency of fiber

表6 不同pH下氨氮质量浓度变化 mg/LTab.6 Changes in ammonia nitrogen concentrations with different pH values

2.3 不同注入氨氮方法对硝化细菌净化速率影响

经上述试验比较，虽无纺布、纤维及聚氯乙烯材质效果无差异，但因无纺布和纤维偏软，在水中长时间浸泡会出现抽丝、腐烂等现象，因此选用聚氯乙烯材质进行试验。

2.3.1 附着基大小筛选比较

选用边长分别为0.5、1.0、2.0、3.0 cm的正方体做附着基，进行氨氮试验，结果见表7。边长1.0 cm试验组相较其他试验组而言，净化效果最好，因此下述试验均选用边长1.0 cm的正方体进行试验。

表7 附着基大小对氨氮质量浓度影响 mg/LTab.7 The change in the size of the attachment to ammonia nitrogen concentration

2.3.2 梯度增加氨氮质量浓度对硝化细菌净化效果影响

梯度氨氮质量浓度对硝化细菌净化效果影响见表8。氨氮梯度增加试验0～1 d，因初始质量浓度均为10 mg/L，且温度、光照等影响因子均相同，所以硝化细菌净化效果大体相同(P>0.05)。1 d时，3、4、5、6组继续注入10 mg/L氨氮，培养环境相同条件下，氨氮质量浓度变化并不明显(P>0.05)。2 d时，第3轮4、5、6组注入氨氮，变化开始明显。3 d开始，氨氮质量浓度变化显著(P<0.05)。最终质量浓度30 mg/L组降解速率开始逐渐下滑。4 d时全组氨氮加入结束，可以发现其他组别降解情况已出现。4～5 d时，50 mg/L组24 h净化效果并不理想(表8)。

表8 氨氮质量浓度梯度试验5 d内氨氮质量浓度 mg/LTab.8 Ammonia nitrogen content in 5 d of ammonia nitrogen concentration gradient experiment

净化效果比较：最终质量浓度为10 mg/L组净化效果为82.3%；最终质量浓度为20 mg/L组净化效果为73.4%；最终质量浓度为30 mg/L组净化效果为60.6%；最终质量浓度为40 mg/L组净化效果为53.2%；最终质量浓度为50 mg/L组净化效果为36.04%。

2.3.3 不同初始氨氮质量浓度对硝化细菌净化效果影响

不同初始浓度氨氮的硝化细菌均于3 d时开始降低，且降解率均达50%以上。低质量浓度时(初始氨氮质量浓度<50 mg/L)，降解率与氨氮质量浓度关系并不明显(P>0.05)，5 d降解率均在80%以上(图5)。

水体5 d内氨氮质量浓度变化见图5。试验0～1 d内50 mg/L为本组净化效果最佳。1～2 d内，净化效果略有下降，但总体净化速率差别不大。在2～4 d内，氨氮被净化速率继续下降。在4～5 d内，硝化细菌净化速率最低。整体比较发现，大多数净化效果前3 d均有大幅度增加，0～1 d时，氨氮净化效果最好。6组中，氨氮净化速率转折时间点大多为3 d。前3 d硝化细菌净化效果优秀的原因可能是因为剩余氨氮质量浓度过高，促进了硝化细菌的生长与繁殖，也可能是因为初始氨氮质量浓度过高，促进硝化反应的正向进行。但3～5 d时，硝化细菌速率下降明显。一次性分别加入氨氮质量浓度10、20、30、40、50、60 mg/L时，其氨氮降解率分别为87%、86%、86%、82%、88%、75%，均高于梯度增加氨氮情况。在初始氨氮质量浓度50 mg/L时，净化效果最好。

图5 不同氨氮初始质量浓度对硝化细菌净化效果Fig.5 Purification effect of different initial concentration of ammonia nitrogen on nitrifying bacteria

3 讨论

3.1 硝化细菌在不同材料上附着效果

6种材料经过灭菌、接种培养、计数后发现，大部分材料对于硝化细菌菌液密度的增加无显著性影响。但纤维材质[19]对硝化细菌菌液密度的增加有着极显著的效果，说明硝化细菌在纤维这种材质上有极好的附着效果；聚氯乙烯材质上硝化细菌的菌液密度也有显著的增加，说明硝化细菌喜欢多孔且表面粗糙的材质；附着基菌液密度结果显示，聚氯乙烯、无纺布、纤维都是硝化细菌偏好的附着基质。以上附着基附着效果均显著高于其他组，说明硝化细菌更喜欢在表面柔软、有弹性的材质上进行挂膜。

在计数试验中，初步认定聚氯乙烯、纤维、无纺布为硝化细菌较为合适的附着基。在经过市场调查之后发现，大部分环保企业喜欢使用流化床、陶粒或火山岩作为生物填料。原因在于这3种材料表面结构坚硬，不易腐蚀，在处理高浓度碱性污水的时候表面不容易被破坏。相比较而言，纤维与无纺布由于表面柔软，在工业处理环境下表面结构比较容易被破坏，导致挂膜效率下降。所以本次试验的培养条件与工业培养相比，比较宽松[20]。在许多生物脱氮工艺中，都采用多种附着基共同培养硝化细菌[21]，本次试验并没有设置混合培养的条件。

3.2 不同附着材料对氨氮降解过程的影响

通过2 d氨氮测定可以发现，除空白组外，所有组的氨氮降解率均在60%～90%间，说明硝化细菌在处理污水时附着基可以明显提高其降解氨氮的效率。而附着基的物理特性使得降解率参差不齐。由于在曝气过程中氧气的上升使得水体不停地翻滚，与附着基结合不牢固的硝化细菌易被冲散导致硝化效率降低[22]。聚氯乙烯、纤维、无纺布这一类附着基表面柔软，材质轻盈，在水体流动过程中会随水流一起流动，所以水流对其表面作用力就小[23]。而陶粒、火山岩、流化床表面坚硬，质量较大，不会随水流而动，所以受到的表面作用力就大，硝化细菌在其表面挂膜易被冲散。在硝态氮和亚硝态氮的转化过程中发现，亚硝态氮在合适的溶解氧条件下很难累积，很快即被转化为硝态氮。聚氯乙烯、纤维、无纺布这3种优秀材质均能显著提高硝化细菌的硝化效率。

3.3 不同初始氨氮质量浓度及氨氮梯度注入对硝化细菌降解影响情况

采用不同初始氨氮质量浓度对硝化细菌进行培养，试验5 d内，在不投加任何额外药品情况下，氨氮质量浓度随时间变化而不断下降。总体来看，前3 d的下降情况最为明显。虽然3 d后硝化细菌依然工作，但趋势不及前3 d明显。经5 d处理后的氨氮废水，可看出不同氨氮质量浓度对养殖废水均有净化效果，但较高质量浓度初始氨氮量废水去除较大，去除效果明显，符合一级反应动力学[24]。当氨氮质量浓度高于50 mg/L时，硝化细菌净化效果不随氨氮质量浓度的增加而增加。其可能原因是附着基所能吸附的硝化细菌数量固定，硝化细菌所能吸收氨氮达最大值。因此不论初始氨氮质量浓度如何增加，净化效果大体均不发生变化。

氨氮质量浓度较高时，可以促进硝化细菌过快生长，仅需3 d硝化细菌数量便开始增加。此时其他物质相对不足，因此抑制硝化细菌生长及去除氨氮等生理功能。所以3 d后氨氮质量浓度下降曲线便出现平滑，发现氨氮去除效果与硝化细菌及硝化速度呈正比。当3 d后硝化细菌到达一定数量时，硝化速率开始降低。由于水体中硝化细菌数量未出现大量增长，故3 d后硝化细菌速率明显降低，未发生新菌完全更替原始硝化细菌的情况，至此硝化细菌降解速率越来越慢。而梯度注入试验整体效果均不如一次性注入降解情况好。该情况对养殖水环境治理有重要意义。

笔者下一步计划探讨藻菌共生的生物脱氮,旨在通过藻类降解养殖废水中的氮、磷等元素，结合细菌降解水体污染物，形成完整的藻菌共生水质净化系统。其中菌类在水中与氧气、污染物结合而生成CO2，为藻类提供了营养所需。同时藻类在水体中生长时进行光合作用，能够有效汲取水中的营养物质，不仅能够合成自身所需营养，还能释放氧气，供给菌类及养殖水生生物存活，实现藻类与菌类互利共生。细菌通过转化水体中的氨氮，来改善养殖水体环境。目前藻菌共生系统在养殖废水及工业废水处理中有诸多应用，对于氮、磷的吸附，重金属的富集及有机物的净化皆有显著优势[25]。这也将是未来硝化细菌在养殖水环境净化中的应用方向。