紫丁香苷对前交叉韧带横断诱导的大鼠骨关节炎的影响

乔 磊，邸振宇，乔 曼，吴敬峰，及 超，杜鑫冲

(1.保定市第二医院骨二科，河北 保定 071000；2.河北北方学院附属第一医院骨外科，河北 张家口 075000)

骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，其发病率呈逐渐上升趋势，特征是关节软骨的退化、丧失以及滑膜炎症，会导致关节僵硬、肿胀、疼痛和活动能力丧失[1]。骨关节炎目前的治疗方式主要为非手术治疗，如运动、营养和药物治疗[2]。目前，用于治疗骨关节炎的大多数药物是非甾体抗炎药，但由于不可避免的副作用，非甾体抗炎药的使用受到很大限制[3]。因此，对于骨关节炎有必要进一步探索新的治疗药物以开发更有效的治疗策略。

紫丁香苷是一种提取自五加科和木犀科根茎的酚苷类化合物，具有抗高血糖、抗抑郁、抗氧化和抗炎镇痛等药理活性[4]。多种用于治疗骨关节炎的中药材和中药复方中均含有紫丁香苷[5-7]，但紫丁香苷治疗骨关节炎的具体作用机制目前尚不清楚。有研究认为，激活的Wnt/β-catenin信号通路参与了骨关节炎的病理过程，其表达水平在Wnt信号通路中发挥重要作用，可促使软骨细胞发挥正常功能[8]。本研究通过构建骨关节炎大鼠模型，探讨紫丁香苷对前交叉韧带横断(anterior cruciate ligament transection，ACLT)诱导的骨关节炎病理损伤、炎症反应及Wnt/β-catenin信号通路的影响，以期为临床防治骨关节炎提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物及主要试剂

72只雄性SD大鼠购自河北医科大学实验动物公共服务平台，6周龄，体质量(190±10)g，动物生产许可证号：SCXK(冀)2020-001，饲养于SPF级屏障实验室。

紫丁香苷(11539)购自中国食品药品检定研究院；双醋瑞因胶囊(J20150097)购自昆明积大制药股份有限公司；苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色液(G1120-100)、番红O-固绿软骨染色液(G1371)购自北京索莱宝科技有限公司；IL-6(ZN2272-PIU)、TNF-α(ARB13318)和IL-1β(ARB10508)ELISA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；一抗MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin购自英国Abcam公司。

1.2 动物模型建立及分组

参照段荔等[9]的方法制作骨关节炎大鼠模型，将大鼠随机分为假手术组、模型组、双醋瑞因组、紫丁香苷25 mg/kg组、紫丁香苷50 mg/kg组和紫丁香苷100 mg/kg组，每组12只。所有大鼠麻醉后于右肢踝骨前内侧髌骨旁依次切开皮肤、筋膜和关节囊，除假手术组外其余各组大鼠均暴露并切断前交叉韧带，行抽屉试验检测前交叉韧带是否断裂成功，断裂成功后用生理盐水进行清洗，复位髌骨，依次缝合关节囊、皮肤等。紫丁香苷25 mg/kg组、紫丁香苷50 mg/kg组、紫丁香苷100 mg/kg组每日分别腹腔注射紫丁香苷25、50、100 mg/kg[10]，双醋瑞因组每日以双醋瑞因54 mg/kg灌胃[11]，假手术组和模型组每日以等量生理盐水灌胃，连续28 d。

1.3 取材

所有大鼠第28天灌胃后禁食12 h，取股动脉血约3 mL置于5 mL肝素钠抗凝管中，4 ℃保存待用。处死所有大鼠并解剖全膝关节，于髌上囊剪开约0.5 cm的切口，用1 mL生理盐水分3次灌洗关节腔，收集关节灌洗液置于硅化试管中。4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清，-20 ℃低温冰冻保存待用。将膝关节用4%福尔马林固定，5%甲酸脱钙，1周后取出，沿关节冠状面切取软骨。

1.4 HE染色

将各组大鼠膝关节软骨组织置于4%多聚甲醛中固定72 h后，用20%乙二胺四乙酸进行脱钙处理，再将其置于梯度乙醇中脱水，随后在石蜡中包埋。将石蜡包埋的组织切成厚度为5 μm的切片，于室温下进行苏木精染色4～10 min，随后伊红染色0.5～2 min。光学显微镜下观察关节软骨组织病理学变化。采用Mankin’s法[12]进行关节病理损伤评分，评分标准：0～1分为软骨正常，2～5分为软骨轻度损伤，6～9分为软骨中度损伤，10～14分为软骨重度损伤。

1.5 番红O-固绿染色

将大鼠膝关节软骨组织石蜡切片脱蜡至水，加入新鲜配制的Weigert染液染色5 min，水洗，酸性分化液分化15 s，随后蒸馏水洗涤10 min，置入固绿染色液中染色5 min，用弱酸溶液洗涤15 s去除固绿，置入番红O染色液内染色5 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封固。于荧光显微镜下观察。采用国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)半定量评分[13]评估骨关节炎严重程度，评分标准：关节软骨结构(0～8分)、软骨基质着色(0～6分)、软骨细胞分布及数量(0～3分)、潮线是否完整(0～1分)及有无骨赘形成(0～3分)，评分越高提示骨关节炎越严重。

1.6 ELISA

取1.3方法中收集的各组大鼠股动脉血，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，并取1.3方法中关节灌洗液，按照ELISA试剂盒说明书检测血清和关节灌洗液中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.7 Western blot

在各组大鼠膝关节软骨组织中加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转移至PVDF膜。4 ℃下加入MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入电化学发光显色液显色。以GAPDH为内参，采用ImageJ V1.8.0.112软件分析各组细胞目的蛋白与GAPDH比值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 骨关节炎关节软骨组织病理损伤程度

假手术组膝关节软骨组织相对保持完整，可见保存完好的光滑软骨表面和软骨细胞，软骨组织正常排列，结构层次清晰，潮线完整。模型组和紫丁香苷25 mg/kg组出现严重和广泛的软骨破坏，关节软骨层状结构消失，软骨表面细胞破损严重且排列紊乱，大量炎性细胞浸润，毛细血管增生，4层结构不易分辨，潮线不完整，出现明显的骨关节炎关节软骨组织病理损伤。双醋瑞因组、紫丁香苷50 mg/kg组和紫丁香苷100 mg/kg组病理损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润、纤维组织增生、排列不规则、毛细血管增生均有不同程度的改善，番红O-固绿染色呈重度减退，潮线断续或多重潮线，可分辨4层结构，软骨细胞增殖，软骨已有不同程度的恢复，见图1、2。

a：假手术组；b：模型组；c：双醋瑞因组；d：紫丁香苷25 mg/kg组；e：紫丁香苷50 mg/kg组；f：紫丁香苷100 mg/kg组

a:假手术组；b：模型组；c：双醋瑞因组；d：紫丁香苷25 mg/kg组；e：紫丁香苷50 mg/kg组；f：紫丁香苷100 mg/kg组

2.2 骨关节炎模型大鼠Mankin’s评分和OARSI评分

与假手术组比较，模型组Mankin’s评分、OARSI评分均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，紫丁香苷25 mg/kg组Mankin’s评分、OARSI评分差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，双醋瑞因组、紫丁香苷50 mg/kg组和紫丁香苷100 mg/kg组Mankin’s评分、OARSI评分均较低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 骨关节炎模型大鼠Mankin’s评分和OARSI评分分)

2.3 骨关节炎模型大鼠血清和关节灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平

与假手术组比较，模型组血清和关节灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，紫丁香苷25 mg/kg组血清和关节灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，双醋瑞因组、紫丁香苷50 mg/kg组和紫丁香苷100 mg/kg组血清和关节灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均较低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 骨关节炎模型大鼠血清和关节灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平

2.4 骨关节炎模型大鼠MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组MMP-13、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平均较高，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表达水平均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，紫丁香苷25 mg/kg组MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，双醋瑞因组、紫丁香苷50 mg/kg组和紫丁香苷100 mg/kg组MMP-13、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平均较低，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表达水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、图4、表3。

a：假手术组；b：模型组；c：双醋瑞因组；d：紫丁香苷25 mg/kg组；e：紫丁香苷50 mg/kg组；f：紫丁香苷100 mg/kg组

a：假手术组；b：模型组；c：双醋瑞因组；d：紫丁香苷25 mg/kg组；e：紫丁香苷50 mg/kg组；f：紫丁香苷100 mg/kg组

表3 骨关节炎模型大鼠MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平

3 讨论

骨关节炎是临床常见病症，虽然手术治疗发展迅速，但药物治疗仍较常用，然而目前的药物仍存在一定的副作用。骨关节炎目前尚无可用的预防或治疗性生物学干预措施，相关的药物制剂还处于探索阶段。目前广泛认为关节软骨的退变是骨关节炎进展的关键[14]，Mankin’s评分和OARSI评分可用于评价大鼠软骨组织结构的退变程度。本研究HE染色和番红O-固绿染色结果显示，紫丁香苷可改善骨关节炎模型大鼠软骨组织损伤，并降低大鼠Mankin’s评分、OARSI评分，提示紫丁香苷对软骨损伤具有保护作用。

骨关节炎是滑膜关节常见的慢性炎症性疾病，炎症反应会促进滑膜中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的过度表达，诱导新生血管、炎症以及基质降解酶的产生，导致软骨降解[15]。Wang等[16]研究发现熊果酸可通过逆转炎症因子IL-1β，IL-6、TNF-α等的上调缓解ACLT诱导的大鼠骨关节炎症状。Ma等[17]研究发现葛根素可通过抑制ACLT大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的产生，从而抑制骨关节炎的发展。本研究ELISA实验表明，骨关节炎模型大鼠经紫丁香苷作用后，血清和关节灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，提示紫丁香苷可通过抑制炎症因子的释放延缓骨关节炎的进展，对关节软骨组织起保护作用。

有研究表明，软骨细胞外基质含量的高低对骨关节炎的病情变化有明显的影响[18]。MMP-13是目前最有效的Ⅱ型胶原纤维降解酶，能够降解软骨基质中的type Ⅱ collagen，在骨关节炎中明显高表达[19]。关节软骨由高分化软骨和细胞外基质组成，而细胞外基质主要由Aggrecan和type Ⅱ collagen组成，二者共同维持软骨的生物力学性能[20]。Aggrecan和type Ⅱ collagen的减少是细胞外基质降解的主要原因，会导致软骨骨架结构受到破坏。本研究Western blot实验表明，骨关节炎模型大鼠经紫丁香苷作用后，MMP-13蛋白表达水平降低，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表达水平升高，提示紫丁香苷可通过抑制细胞外基质的降解改善骨关节炎。

Wnt/β-catenin信号通路通过调节成骨细胞和软骨细胞分化产生蛋白酶而参与骨关节炎的发病过程，其在骨关节炎发病过程中呈过度激活状态[21]。中医药干预Wnt/β-catenin信号通路可通过下调Wnt、β-catenin蛋白表达促进关节软骨细胞增殖或抑制相关基因的表达，从而起到治疗骨关节炎的作用[22]。Zhong等[23]研究发现青蒿素可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减轻IL-1β介导的炎症反应并延缓骨关节炎进展。Ding等[24]研究发现大黄素干预可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来防止骨关节炎模型兔软骨退变并延缓疾病进展。本研究Western blot实验表明，骨关节炎模型大鼠经紫丁香苷作用后，Wnt1、β-catenin蛋白表达水平降低，提示紫丁香苷可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化对骨关节炎大鼠关节软骨组织起保护作用。

综上所述，紫丁香苷可通过抑制炎症反应、细胞外基质的降解及Wnt/β-catenin信号通路的活化改善ACLT诱导的骨关节炎大鼠软骨组织病理损伤，对骨关节炎大鼠关节软骨组织起保护作用。